sEphB4抑制视网膜新生血管和玻璃体增殖的研究*

颜坚姜文浩彭细峰黎颖莉



sEphB4抑制视网膜新生血管和玻璃体增殖的研究*

颜坚①姜文浩①彭细峰①黎颖莉①

【摘要】目的：探讨sEphB4抑制视网膜新生血管和玻璃体增殖的作用。方法：建立长期DR兔眼模型，将所有DR兔的右眼作为药物干预眼，给予sEphB4 50 μL玻璃体腔内注入，sEphB4的剂量依次为1000、465、160、80 μg。左眼作为对照眼，给予生理盐水50 μL玻璃体腔注入。此干预治疗持续6个月，注射1次/月。比较两组OCT及明暗ERG干预前后的变化。结果：糖尿病兔模型FFA的渗漏减轻，糖尿病模型的OCT变厚，干预后逐渐变薄并与剂量的增加呈负相关，剂量越大OCT测量的视网膜厚度越薄越接近正常厚度。糖尿病兔模型ERG的aA值随着剂量的增加逐渐降低，干预后逐渐接近正常值，并与剂量成正相关。结论：sEphB4可以抑制糖尿病视网膜病变兔模型的视网膜水肿，以及改善视网膜功能。

【关键词】sEphB4抑制； 视网膜； 新生血管； 玻璃体增殖

①广东省深圳市龙岗中心医院 广东 深圳 518116

Medical Innovation of China，2016，13（16）：139-141

First-author's address：Shenzhen City Longgang Central Hospital，Shenzhen 518116，China

糖尿病视网膜病变（DR）是最主要的致盲眼病之一，其有效治疗是眼科基础研究和临床亟待解决的课题。因此，开展对DR发病机制方面的实验研究具有重要意义。内皮细胞受体酪氨酸激酶（Endothelial cell receptor tyrosine kinases，PTKs）是血管生成的最重要的介质之一，目前已有许多研究证实，Eph/Ephrin作为RTKs亚族中最大的一支，其家族中的EphB4/EphrinB2信号通道对于细胞的迁移、粘附和增生起着定位作用。在早产儿增殖性视网膜病变和激光诱导的视网膜脉络膜新生血管等类似于PDR病理改变的动物模型中，均检测到EphB4/EphrinB2信号通道的激活及sEphB4在体外和活体中抑制脉络膜新生血管作用明显，且其可在体外通过抑制PDGF介导RPE细胞的黏附、增殖和迁移［1-2］。

同时，最新研究也表明sEphB4在高浓度状态下对活体组织无毒性损害且其玻璃体、视网膜穿透能力强，为sEphB4可能会成为新一类的治疗DR等一系列增殖性玻璃体视网膜病变提供了有利的理论支持。本文旨在通过长期DR兔眼模型，研究sEphB4对PDR中视网膜新生血管和玻璃体增殖的抑制的作用机理，现报道如下。

1　材料与方法

1.1主要仪器 FFA、OCT、明暗电生眼仪、全血分析、系统显微镜及图像分析系统（Zeiss LSM510 META Imager 21；Zeiss Laser Module Zeiss公司）、全自动PCR 扩增仪（Icycler BIO-RAD公司）、高速台式离心机（5417C型，Eppendorf 公司）、真空离心系统（Speed Vac plus SC110A和Universal Vacuum system UVS400 SAVANT公司）、无菌超净工作台（Class Ⅱ B2型，NUAIRE公司）、凝胶数字成像系统（Universal Hood Ⅱ型，BIO-RAD公司）、凝胶电泳系统（PowerPac 200型，BIO-RAD公司）等。

1.2方法 （1）糖尿病兔模型建立：选用8～10周的雄性兔4只，麻醉后予5%四氧嘧啶150 mg/kg耳缘静脉注射，注射前不需禁食。麻醉恢复后予高糖高脂饮食，并在4、8和12 h皮下注射5% GS 10 mL，注射四氧嘧啶后每12小时测一次血糖直至1周得到每只兔的血糖变化曲线。对于血糖持续低于300 mg/dL的实验对象于1周时予第2次5%四氧嘧啶100 mg/kg静脉注射，注射后只需持续监测血糖，不需做特殊处理。对于连续3次晨间血糖高于350 mg/dL的实验对象根据血糖升高程度予胰岛素皮下注射，采耳中央动脉血1次/周及尿液24 h/次。距试验开始1个月时，若试验对象持续血糖＞300 mg/dL且血液及尿液中出现糖基蛋白、尿素氮、尿糖、尿蛋白升高及电解质紊乱，则表明糖尿病兔模型建立。之后改为检测血糖1次/周和耳中央动脉1次/月，采血及尿液。（2）兔眼DR模型：糖尿病兔模型发展到7～8个月时，兔视网膜血管出现扭曲和扩张，10个月左右出现荧光渗漏。糖尿病兔模型发展到6个月后进行1次/月FFA、OCT、眼压及明暗电生理检查。12个月时将所有双眼FFA出现荧光渗漏的兔选为实验对象，至此，兔眼DR模型成功建立。（3）分组进行玻璃体腔内sEphB4不同剂量多次注射，将所有DR兔的右眼作为药物干预眼给予sEphB4 50 μL玻璃体腔内注入，sEphB4的剂量依次为1000、465、160、80 μg。左眼作为对照眼，予生理盐水50 μL玻璃体腔注入。此干预治疗持续6个月，注射1次/月。（4）视网膜、玻璃体增殖膜及眼球各部位样本收集，在干预对照实验结束时将兔麻醉下予巴比妥酸盐100 mg/kg静脉内注射致死后，进行眼球摘除并实行：①全视网膜完整取样：沿角巩缘360°去除角膜，小心去除晶体，将眼球从4个象限蝴蝶状剪开，并用4%多聚甲醛（PFA）固定45 min后，清除玻璃体，PBS清洗3次，10 min/次，显微镜下完整取出视网膜平铺放置于OCT包埋剂中包埋，干冰凝固后保存于-80 ℃，实验时取出，用冰冻切片机以5 μm厚度切片。②玻璃体增殖膜，视网膜取样：用上述方法固定组织后，显微镜下取出带有玻璃体增殖膜的视网膜脱水后，放置于OCT中包埋，凝固，-80 ℃储存，切片。

1.3统计学处理 使用PEMS 3.1统计软件及Microsoft excel 2007软件进行分析，计量资料采用（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05为有差异有统计学意义。

2　结果

糖尿病兔模型FFA的渗漏减轻，正常组兔的OCT（122.15±7.24）μm，而糖尿病模型的OCT变厚，干预后逐渐变薄并与剂量的增加呈负相关，剂量越大，OCT测量的视网膜厚度越薄越接近正常厚度。ERG是客观有效放映视网膜功能变化的一个敏感指标，正常兔眼的ERG的aA值为（79.39±11.23），糖尿病兔模型ERG的aA值随着剂量的增加逐渐降低，干预后逐渐接近正常值，并与剂量成正相关，见表1。

表1　两组各项检查指标干预前后的变化情况（±s）

表1　两组各项检查指标干预前后的变化情况（±s）

组别OCT μm 明暗ERG的aA值干预前　　干预6个月后　　干预前　　干预6个月后干预组（n=4）1000 μg　 177.80±15.50　122.88±15.41　60.45±13.22　79.13±10.52 465 μg　163.31±21.52　128.27±11.72　64.12±12.48　76.35±11.34 160 μg　152.20±19.57　132.27±13.38　70.34±11.32　74.24±12.03 80 μg　134.16±25.03　136.43±11.32　75.25±13.56　71.82±11.75对照组（n=4）　122.15±7.24　120.8±17.86　79.39±11.23　80.43±12.82

3　讨论

长期的高血糖、多元醇、肌醇代谢异常会导致血液流变学改变，氧化应激、炎症/免疫系统活化，细胞因子/生长因子表达或活性改变，以致视网膜血管内皮损伤，毛细血管内皮细胞开始增殖，血管渗漏、闭塞，缺氧的网膜组织释放出血管增殖物质，促使新生血管形成，进而导致出血、机化，而发生增殖性病变，并造成极其严重的不良后果［3］。一系列研究证实，PTKs是血管生成的最重要的介质之一，包括血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）受体、血管生成素（angiopoietin，Tie）受体和红细胞生成素诱导的肝细胞（erythropoietin-producing hepatocellular，Eph）受体。Eph受体与它的Ephrin配体一起组成了PTKs亚族中最大的一支，有14个受体和8个配体。这个家族基于序列同源性粘附于Ephrin配体，再细分为EphA和EphB两组［2］。Eph/Ephrin调控着不同系列的细胞功能，如细胞迁移、增殖和黏附，他们对于脉管系统的发展也有着重要的影响［4］。已有实验表明，视网膜内皮细胞表达EphrinB2，一个细胞外域的EphB4受体的可溶性单体形式（sEphB4），可以竞争性抑制受体激活，从而在总体上阻断内皮细胞功能和视网膜脉络膜的新生血管［5］。同时，基于EphB4/EphrinB2在调节细胞黏附、生长和迁移中起着重要作用，目前也有体外实验证实，EphrinB2 和Ephb4表达在人类视网膜色素上皮细胞和增殖性玻璃体视网膜病变膜内的细胞上。sEphB4可抑制血小板衍生生长因子介导RPE细胞内的EphB4和EphrinB2磷酸化，从而抑制RPE细胞的迁移、黏附和增殖［6］。本项目拟采用经典的类似于DR晚期PVR的兔眼模型，首次针对sEphB4在DR活体中抑制玻璃体增殖进行系统研究。结果显示，糖尿病兔模型OCT是变厚的，干预后逐渐变薄并与剂量的增加呈负相关，剂量越大，OCT测量的视网膜厚度越薄越接近正常厚度。ERG是客观有效放映视网膜功能变化的一个敏感指标，正常兔眼的ERG的aA值为（79.39±11.23），糖尿病兔模型ERG的aA值随着剂量的增加逐渐降低，干预后逐渐接近正常值，并与剂量成正相关。最新动物研究显示，浓缩状态下的sEphB4对于兔眼无毒性作用，实验组与对照组的兔眼眼内压，明暗电生理和组织病理学等方面比较差异均无统计学意义（P＞0.05），且药物动力学研究展示sEphB4在视网膜和脉络膜中的平均存留时间明显优于传统的抗VEGF药［7-10］。但由于DR患眼中的微环境及各类因子已较正常眼发生了巨大的变化，所以对于sEphB4在DR眼中的安全性及药物动力学方面有待进一步研究。

综上所述，通过对sEphB4抑制DR视网膜新生血管的研究，证实sEphB4在活体中具有抑制RPE细胞黏附、增殖、迁移的作用，对一系列增殖性视网膜病变的临床药物研究具有指导性意义［11-15］。

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The Study of sEphB4 Inhibition on Retinal Neovascularization and Vitreous Proliferation

YAN Jian，JIANG Wen-hao，PENG Xi-feng，et al

【Key words】sEphB4 inhibition； Retina； Neovascularization； Vitreous proliferation

【Abstract】Objective：To investigate the effect of sEphB4 on inhibiting the proliferation of retinal neovascularization and vitreous proliferation.Method：The long term DR rabbit eye model was established，the right eyes of all DR rabbits were treated as drug intervention which 50 μL sEphB4 was injected into the vitreous cavity，the dose of sEphB4 was respectively 1000，465，160 and 80 μg.Left eyes as the control eyes，they were given the physiological saline 50μL vitreous cavity injection. This intervention treatment lasted 6 months，1 time a month injection.The changes of OCT and ERG before and after the intervention of two groups were compared. Result：The FFA leakage of the diabetic rabbit model reduced，diabetic model of OCT thickened，after the intervention becomes thin and with dose increasing negative correlation，with the increase of concentration，measured by OCT retinal thickness of the thinner closer to normal thickness.Diabetic rabbit model of ERG aA values gradually decreased with the increase of the dose，after the intervention of gradually close to normal value， and is positively correlated with the dose.Conclusion：sEphB4 can inhibit the retinal edema in rabbit model of diabetic retinopathy，and improve the function of the retina.

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.16.039

*基金项目：深圳市科技研发资金资助项目（JCYJ20150403091931178）

通信作者：颜坚

收稿日期：（2016-02-01） （本文编辑：周亚杰）