不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致病力

2016-07-01向玉勇隋姗姗

浙江大学学报（理学版） 2016年4期

关键词：苏云金尺蠖金银花

向玉勇，隋姗姗，刘冲，郑怡

(滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000)

不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致病力

向玉勇，隋姗姗，刘冲，郑怡

(滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000)

为了掌握苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)对金银花尺蠖(HeterolochajinyinhuaphagaChu)幼虫致病的最佳条件，测定了不同温度、不同浓度下的苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致死作用.结果表明，在15～35 ℃，苏云金芽孢杆菌浓度为1×104,1×105,1×106,1×107,1×108,1×109芽孢·mL-1，各浓度下对金银花尺蠖幼虫均有一定的致死作用，在31 ℃时校正死亡率达到最大，分别为60.32%, 67.24%, 72.41%, 79.31%, 84.48%和91.38%，同一温度下的校正死亡率随着浓度的升高显著上升.方差分析显示，温度和浓度的交互作用对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率没有显著影响(p>0.05).由所建立的拟合模型计算可得各浓度对应的校正死亡率最大温度分别为29.88, 31.54, 32.50，31.17，33.28和32.75 ℃.毒性分析表明，31 ℃时苏云金芽孢杆菌的毒性最强，LC50值为2.70×103芽孢·mL-1，高于或低于31 ℃，其毒性有所下降.

苏云金芽孢杆菌；金银花尺蠖；温度；校正死亡率；毒性

金银花尺蠖(HeterolochajinyinhuaphagaChu) 是近年来新发现的一种危害金银花的食叶害虫，该虫属鳞翅目尺蛾科，别名拱腰虫，在河南、山东、安徽等地已有报道[1-4].由于该虫的取食危害，常引起金银花大面积减产，甚至成片死亡.目前，国内主要通过化学手段来防治金银花尺蠖[2-3, 5]，但长期不合理使用化学农药，不但会杀伤天敌，也增强了害虫的抗药性，而且还会使金银花中农药大量残留，降低药材品质.因此，需寻找新的无公害防治方法以保障金银花的产量和品质.

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)，在形成芽孢的同时会在菌体的一端或两端形成伴胞晶体(parasporal crystal)，被昆虫吞噬后，伴胞晶体在昆虫中肠特殊酸碱度条件下溶解，并释放出杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，这种杀虫晶体蛋白被中肠拟胰蛋白酶激活后能特异性地与中肠上皮细胞受体结合，改变细胞膜的通透性，引起细胞代谢失调导致昆虫死亡[6-7].因此，苏云金芽孢杆菌具有非常高的生物防治价值，已被制成微生物杀虫剂，即Bt杀虫剂，广泛用于害虫防治，其杀虫谱已扩大到鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目、虱目和蚤目9个目的200多种害虫[8-9].由于Bt杀虫剂具有生产方便、成本低廉、致病力强、不伤害天敌、对人、畜无毒害、不污染环境等优点，已成为世界上产量最大、效果最好的微生物杀虫剂.我国Bt制剂的产量已超过2×104t，每年应用面积可达4×106hm2，主要用来防治马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、柳蓝叶甲(Plagioderaversicolora)、光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)、松墨天牛(Monochamusalternatus)等鞘翅目害虫[10-12]，以及小菜蛾[Plutellaxyllostella(Linnaeus)]、菜青虫(PierisrapaeLinne)、棉铃虫(HelicoverpaarmigeraHubner)、大豆天蛾(Clanisbilineata)、茶毛虫(EuproctispseudoconspersaStrand)、玉米螟(Ostrinianubilalis)、三化螟[Tryporyzaincertulas(Walker)]、苹果巢蛾(YponomeutapadellaLinnaeus)、马尾松毛虫(DendrolimuspunctatusWalker)、油桐尺蠖(BuasrasuppressariaGuenee)等鳞翅目害虫[13].但害虫的种类繁多，苏云金芽孢杆菌对不同昆虫的致病能力存在差异，其杀虫效果还受温度、湿度、光照等多种环境因素的影响，有关苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖的致病力还未见报道. 本文研究不同温度条件下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致病力，旨在寻找苏云金芽孢杆菌感染金银花尺蠖幼虫的最佳温度条件，为该虫的生物防治提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

苏云金芽孢杆菌菌株ATCC10792，购于广东环凯微生物科技有限公司.

1.2 供试虫源

从明光市三界镇野生金银花上采集金银花尺蠖幼虫，带回实验室，放在人工气候箱中用新鲜的金银花叶片饲养.人工气候箱的光周期L∶D设置为14∶10，温度为25±1 ℃，相对湿度为(70±7)%.选取大小一致的健康老熟(5龄)幼虫作为试验材料.

1.3 培养基

基础培养基：3.0%牛肉膏、1.5%琼脂、5.0% NaCl、10.0%蛋白胨.

液体培养基：豆饼粉4.5%、淀粉2.0%、玉米粉2.0%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.1%、磷酸二氢钾0.1%.

1.4 菌悬液制备

取苏云金芽孢杆菌菌种接种于基础培养基斜面，在32 ℃下培养24 h，然后移入液体培养基中，30 ℃下经摇床震荡培养48 h长出芽孢和伴胞晶体.收集培养物，用离心机离心10 min (2 000 r·min-1)，除去上清液，取沉淀用无菌水制备成1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109芽孢·mL-16个浓度的菌悬液待用.

1.5 苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致死作用分析

设置15，19，23，27，31，35 ℃ 6个温度，将不同浓度的菌悬液喷洒在金银花叶片上，风干后放在一次性塑料杯中，接入1头5龄老熟金银花尺蠖幼虫，杯口覆上保鲜膜，并用昆虫针扎许多小孔透气，然后置于人工气候箱中，24 h后改用未喷洒菌悬液的新鲜金银花叶片饲养，72 h后观察并记录幼虫的死亡情况(死亡幼虫身体发黑、僵直，体壁破后有黑色液体流出).每个温度下各浓度的菌悬液分别测定20头幼虫，实验重复3次，并以喷洒无菌水的叶片作对照.根据下列公式计算死亡率和校正死亡率：

死亡率=(死亡虫数/处理试虫总数)×100%，

校正死亡率=[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100%.

2 数据分析

采用SPSS 11.5统计软件对数据进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法作差异显著性检验.

3 结果与分析

3.1 不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖的致死作用

在15～35 ℃的温度范围内，各浓度的苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫均有一定的致死作用(见表1)，不同温度下的校正死亡率存在显著差异，15 ℃时最低，各浓度的校正死亡率分别为32.76%，39.66%，44.83%，51.72%，56.89%和63.79%，随着温度的升高，校正死亡率不断上升，31 ℃时达到最大，分别为60.32%，68.24%，72.41%，79.31%，84.48%和91.38%.35 ℃时校正死亡率开始下降，分别为52.73%，61.82%，69.10%，74.55%，81.82%和87.27%.在同一温度下，苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率随着浓度的升高而上升，差异达显著水平.

方差分析显示(见表2)，温度和苏云金芽孢杆菌浓度交互作用的p值大于0.05，说明温度和苏云金芽孢杆菌浓度的交互作用对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率没有显著影响.

表1 不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率Table 1 Corrected mortality of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva at different temperatures

表中数据为M±SE，后面标注的英文字母为多重比较的结果，同一行中不同大写字母表示不同温度下的校正死亡率数据差异显著(p<0.05)，同一列中不同小写字母表示不同浓度下的校正死亡率数据差异显著(p<0.05)，否则不显著.

The data in the table are mean±SE，the marked letters after them show the results of multi comparison. In the same line, the different capital letters mean a significant difference between different temperatures (p<0.05)，and the different lower case letters in the same row mean a significant difference between different dosages (p<0.05), otherwise mean no difference.

表2 不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫校正死亡率的方差分析Table 2 Two-way ANOVA on the corrected mortality of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva at different temperatures

注表中字母A为温度，B为浓度，SS为平方和，DF为自由度，MS为均方，e为误差，T为总和.

Notes The letters A, B, SS, DF, MS, e and T represent temperature, dosages, sum of squares, degree of freedom and mean square, error and total, respectively.

3.2 苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率与温度的拟合模型

通过分析建立金银花尺蠖幼虫的校正死亡率与温度间的拟合模型(见图1)，苏云金芽孢杆菌浓度为1×104,1×105,1×106,1×107,1×108,1×109芽孢·mL-1时的拟合方程分别为y=-0.112x2+6.692 7x-42.784，y=-0.090 5x2+5.708 8x-25.737，y=-0.084 9x2+5.518 2x-18.98,y=-0.089 4x2+5.730 9x-14.965,y=-0.078 4x2+5.218 5x-3.832,y=-0.082 9x2+5.430 2x+0.203 3，式中x为温度(℃)，y为校正死亡率(%)，R2值分别0.965 9,0.968 9,0.982 4,0.975 3,0.984 3和0.978.表明所建模型能够反映试验温区的实际变化规律，模型成立.根据所建模型可以计算出各浓度苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫校正死亡率最高时的温度分别为29.88,31.54,32.50,31.17,33.28和32.75 ℃.

图1 苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率与温度的拟合模型Fig.1 Regression models about the corrected mortality of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva and temperatures

3.3 不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的毒性

毒性测定结果显示(见表3)，在15,19,23,27,31,35 ℃ 6个温度梯度下，苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫均有一定的毒性，其LC50值分别为1.77×106，2.17×105，6.12×104，1.52×104,2.70×103和1.51×104芽孢·mL-1，说明在15～31 ℃范围内，随着温度的升高，苏云金芽孢杆菌的毒性在增强，当温度高于31 ℃后，毒性开始下降.

表3 不同温度下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的毒性Table 3 Toxicities of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva at different temperatures

4 讨论

温度是影响微生物杀虫剂杀虫效果的一个重要因素，笔者研究了不同温度条件下苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致死作用.结果表明，温度能在很大程度上影响苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的致死效果.在15～35 ℃，31 ℃最有利于苏云金芽孢杆菌感染金银花尺蠖幼虫，温度过高或过低，都会降低其致死作用，尤其是高温，各温度下的差异显著，可能是由于高温或低温条件影响了芽孢和伴胞晶体的产生，从而影响致死效果. 汪敏捷等[14]研究了不同温、湿度下白僵菌对红缘天牛幼虫的致病力，也得到了类似结果.在同一温度下，苏云金芽孢杆菌对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率随着浓度的升高而上升，差异显著.方差分析显示，温度和苏云金芽孢杆菌浓度的交互作用对金银花尺蠖幼虫的校正死亡率没有显著影响(p>0.05).

根据建立的金银花尺蠖幼虫的校正死亡率与温度间的回归模型计算得出：苏云金芽孢杆菌在浓度为1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109芽孢·mL-1时，金银花尺蠖幼虫校正死亡率最高时的温度分别为29.88,31.54,32.50,31.17,33.28和32.75 ℃. 毒性测定结果也说明温度在15～31 ℃，苏云金芽孢杆菌的毒性随着温度的升高而增强，温度高于31 ℃时，毒性开始下降.因此，在利用苏云金芽孢杆菌制剂进行生物防治时，应避开高温环境，可以选择在阴天施药，以充分发挥其药效.

目前，国内关于苏云金芽孢杆菌的杀虫效果已有较多报道，但所选用的菌株不一样，其杀虫效果亦存在一定差异，并且杀虫效果还受湿度、光照等多种环境因素的影响.本研究只选用了一种菌株，测定不同温度下其对金银花尺蠖幼虫的致死作用.今后还应选择不同菌株，研究温度、湿度、光照等因素综合作用下的致死作用，以确定不同菌株的最佳作用条件，为金银花尺蠖的生物防治提供科学依据.

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Pathogenicity ofBacillusthuringiensistoHeterolochajinyinhuaphagaChu larvae at different temperatures.

XIANG Yuyong, SUI Shanshan, LIU Chong, ZHENG Yi

(SchoolofBiologyandFoodEngineering,ChuzhouUniversity,Chuzhou239000，AnhuiProvince,China)

To obtain the optimal pathogenicity conditions ofBacillusthuringiensis(Bt) toHeterolochajinyinhuaphagaChu larvae, the lethal effects of Bt onH.jinyinhuaphagaChu larvae at different temperatures and dosages were tested in laboratory. The dosages of Bt were set as 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109spores·mL-1. The result showed that Bt at each dosage had a certain lethal effect onH.jinyinhuaphagaChu larvae in the range from 15 to 35 ℃. The corrected mortality reached the highest level at 31 ℃, which was 60.32%, 67.24%, 72.41%, 79.31%, 84.48% and 91.38%, separately, and it would decrease significantly at lower or higher temperatures. At the same temperature, the corrected mortality would increase when the dosage was added. Two way ANOVA showed that the interaction of temperatures and dosages had no significant effect on the corrected mortality ofH.jinyinhuaphagaChu larvae(p>0.05). According to the established regression model, the optimum temperatures for the biggest corrected mortality at each dosage were calculated as 29.88, 31.54, 32.50, 31.17, 33.28 and 32.75 ℃, respectively. Toxicity analysis showed that the toxicity of Bt was strongest at 31 ℃, and it’s LC50value was 2.70×103spores·mL-1. The toxicity of Bt would decrease at the temperatures higher or lower than 31℃.

Bacillusthuringiensis;HeterolochajinyinhuaphagaChu; temperature; corrected mortality; toxicity