一种防治小菜蛾的菌剂制备方法和药效评价

刘春光　杨峰山

小菜蛾，鳞翅目菜蛾科，别名：小青虫、两头尖，是田间常见的害虫之一，是世界性迁飞害虫。主要为害甘蓝、紫甘蓝、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、萝卜等十字花科植物。苏云金芽孢杆菌杀虫剂自1938年在法国问世以来，已取得了长足的发展，开发的剂型也已经有很多种，近一百年的研究开发，使得以苏云金芽孢杆菌微生物源的微生物杀虫剂逐渐成熟完善，田问防治效果达到80%以上的在我国就有二十多种，但在应用过程中还存在主要起效成分不稳定。致使活性成分的保质期和持效期差等众多问题。苏云金粉剂所含伴孢晶体和芽孢以干粉状态存在，具有耐贮藏、运输方便、使用性强、效价高等特点。但由于粉剂不易被水湿润，也不易分散和悬浮在水中，稀释喷雾较困难。

普鲁兰多糖具为白色非吸湿性的粉状物，无毒、无致畸性、无味，易溶于冷水，具有水溶性、成纤维性、吸水性等独特的性质，由于普鲁兰多糖良好的成膜特性，更有助于保持苏云金芽孢杆菌的活性，因此利用普鲁兰多糖作为药物释放系统载体材料的研究越来越受到人们的重视。本研究以东北地区田问非正常死亡的小菜蛾幼虫作为实验材料，从其体内成功分离出对东北地区小菜蛾具有高毒性的苏云金芽孢杆菌，开发了一种防治小菜蛾的含有普鲁兰多糖的苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，并进行了药效评价。

1菌剂的制备方法

1.1配制LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，固体培养基再加入琼脂粉15g/L；取保藏的苏云金芽孢杆菌接种于LB固体斜面培养基上，在30℃条件下培养24h，然后再在LB固体斜面培养基上用接种环挑取菌苔转接于5mL LB液体培养基中，在30℃条件下，以200r/min的转速摇菌12h，作为苏云金芽孢杆菌种子菌液；

1.2配制发酵培养基：将葡萄糖、黄豆饼粉、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、磷酸氢二钾和氯化钙溶解于水中配制培养基，其中葡萄糖20g/L，黄豆饼粉20g/L，酵母粉16g/L，鱼粉20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾20g/L，氯化钙230g/L，调pH值至6.8-7.0，装入250mL三角瓶中。在0.14Mpa压力下灭菌30min；然后将种子菌液按体积分数为2%接种于50mL发酵培养基中，在30℃条件下。以200r/min的转速摇菌40-50h，直至芽孢脱落量为45%-55%。得到苏云金芽孢杆菌发酵液；

1.3用1mol/L醋酸溶液将发酵液调至pH值4.5，然后分装到2个离心管中，以5000-8000r/min转速离心20min，然后回收沉淀，得到芽孢和伴孢晶体混合物，芽孢和伴孢晶体的数量比为0.8-1.2：1；

1.4按重量百分比加入50%-70%芽孢和伴孢晶体混合物、0.5%-5%的载体和1%-5%的氯化钠，搅拌均匀；

1.5混匀后按重量百分比加入5%-20%的润湿剂和5%-20%的分散剂。搅拌均匀。在50-70℃条件下烘干至含水质量百分数3%-4%时取出，然后研磨，再经过200目筛子，得到一种苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂。

2菌剂载体、润湿剂和分散剂的选择

制备方法中步骤四中的载体为人造沸石、高岭土或硅藻土；步骤五中的润湿剂为十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠，分散剂为普鲁兰多糖或羟甲基纤维素钠。按照上述方法制备后，统计活芽孢含量，测定后得出载体对苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂中的芽孢具有保护作用，且不同载体对苏云金芽孢杆菌的保护作用有差异，如高岭土和硅藻土在重量百分比1.0%-3.0%浓度时对苏云金芽孢杆菌的保护作用达到最高值。而人造沸石则在重量百分比5.0%的浓度下才能达到较高的保护作用；而且加了润湿剂的样品润湿时间明显少于不加润湿剂的对照，其中润湿剂十二烷基苯磺酸钠的效果较好。

3菌剂对小菜蛾的药效试验

将含普鲁兰多糖苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂和含羟甲基纤维素钠苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂分别保存1天、3个月和6个月时，利用小菜蛾2龄幼虫进行生物活性测定。

具体测定方法为：用浸叶法将制备好的含不同分散剂的苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂分别稀释至10-3，均匀涂抹在新鲜的甘蓝菜叶上，自然晾干后放人9cm平皿内，底部放湿滤纸，每皿接人幼虫20头。每个处理重复3次，同时用无菌水涂抹在新鲜的甘蓝菜叶上做空白对照，处理后置于温度为26±1℃，光照时间达14h的生化培养箱中培养，72h后观察小菜蛾幼虫的生长状况，记录活虫数。计算校正死亡率。

4菌剂的药效评价

本研究制备的含有普鲁兰多糖的苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂中苏云金芽孢杆菌活芽孢含量8±0-9±2×109个/g，pH7.2；通过200目筛后细度为99.9%，而目前国家标准细度为98%；悬浮率（即有效含量）72%，高于目前国家标准的悬浮率70%；润湿时间为123s。明显缩短于国家标准润湿时间180s；水分重量百分数3.8%。国家标准为4%；保存期6个月时用本研究得到的普鲁兰多糖的苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂处理，校正死亡率为96%，苏云金芽孢杆菌的活性高。而使用羟甲基纤维素钠制备的苏云金芽孢杆菌粉剂校正死亡率仅为90%。

综上所述，本研究得到的粉剂中苏云金芽孢杆菌的活性高，保质期和持效期长，能够广泛应用于田间防治农业害虫领域。