喉癌TU177细胞系中CD133+CD44+肿瘤干细胞分选及特性分析

杨俊岭，高伟，王珏，付荣，陈波，李伟艳，温树信，王斌全（1.山西医科大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科；.耳鼻咽喉头颈肿瘤山西省重点实验室，山西医科大学耳鼻咽喉研究所；3.山西医科大学第一医院口腔科）



喉癌TU177细胞系中CD133+CD44+肿瘤干细胞分选及特性分析

杨俊岭1，2，高伟1，2，王珏2，3，付荣2，陈波2，李伟艳2，温树信1，2，王斌全1，2
（1.山西医科大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科；2.耳鼻咽喉头颈肿瘤山西省重点实验室，山西医科大学耳鼻咽喉研究所；3.山西医科大学第一医院口腔科）

摘要：目的：免疫磁珠分选喉癌TU177细胞系中的CD133+CD44+细胞，探讨CD133+CD44+细胞作为肿瘤干细胞的生物学特性。方法:培养喉癌TU177细胞，采用免疫磁珠分选技术分选CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-细胞，流式检测分选效率，检测各组细胞的增殖、侵袭、迁移、粘附、克隆形成能力。结果：CD133+CD44+细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附、克隆能力均明显高于其他组，差异有统计学意义（P＜0.0001）。结论：免疫磁珠技术能有效进行TU177细胞系的分选，CD133+CD44+细胞亚群具有强增殖、侵袭、迁移、粘附、克隆形成能力，具有肿瘤干细胞特征，CD133作为干细胞标志物，其干细胞特性强于CD44，可为喉癌的进一步靶向治疗提供依据。

关键词：喉癌；CD133；CD44；TU177；磁珠分选；肿瘤干细胞

肿瘤干细胞假说提供了肿瘤起始和进展的模型，从这一模型可以得出只有一部分亚群的肿瘤细胞拥有特定保持肿瘤干性的能力［1］。研究表明一部分肿瘤的复发与转移归因于肿瘤干细胞，有证据表明肿瘤干细胞存在于头颈部肿瘤中，对肿瘤的诊断、预后治疗有很大影响。喉肿瘤同样有一群小部分细胞具有无限增殖、分化和体外克隆的能力，这一小部分细胞是肿瘤的起源细胞，维持整个瘤体的更新和生长，侵袭和迁移，被命名为肿瘤干细胞［2］。我们选用喉鳞癌TU177细胞系，应用细胞表面标志物CD133、CD44将喉癌TU177细胞进行分组筛选，对该细胞群进行干细胞生物学特性的初步探讨，为今后喉癌干细胞的分离和鉴定奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1实验材料

人喉鳞癌 TU177细胞株来源于耳鼻咽喉头颈肿瘤山西省重点实验室，10％小牛血清（美国GIBCO公司）、MEM培养液（美国GIBCO公司）

1.2主要试剂

FITC-CD44抗体及同型对照（美国，BD），PE-CD133抗体及同型对照 、anti-PE multisort kit 、anti-FICT磁珠和 LS 分选柱（德国，Miltenyi）

1.3实验方法

1.3.1TU177细胞系的培养及筛选

收集对数期TU177细胞，CD133-PE抗体避光孵育，洗涤，加抗PE磁珠混匀，避光孵育，过柱，阳性收集管中为CD133+细胞标记为A，阴性收集管中为133-细胞标记为B。将得到A组加磁珠剪切剂孵育，洗涤，加停止剪切剂，得到去除磁珠的CD133+细胞标记为C。将得到的B、C组细胞和CD44磁珠孵育，C细胞过柱得到2组细胞为CD44+CD133+、CD44-CD133+，B组细胞过柱得到2组细胞为CD44+CD133-、CD44-CD133-。

1.3.2流式细胞仪检测细胞纯度

1.3.3增殖实验

细胞计数，调整浓度为1×105/ml，每组细胞取100ul，设3个复孔，分别于第1、2、3、4、5天，加CCK-8孵育1小时，450nm测定吸光度值，计算均值。

1.3.4侵袭实验

细胞计数仪计数，调整浓度为1×105/mL。取基质胶包被的transwell小室，下室加含20％FBS 的MEM，上室加200uL细胞，每组3个复孔，培养48小时后取出小室，PBS清洗，甲醛固定，轻擦上室，冰醋酸溶解，测OD值。

1.3.5迁移实验

同侵袭实验，用未用基质胶包被的小室。

1.3.6克隆形成实验

细胞计数，稀释至300个/mL，置35mm2培养皿中培养，2周后PBS清洗，甲醛固定，结晶紫染色，冰醋酸溶解，测OD值。

1.3.7细胞粘附实验

细胞计数为1×105个/mL，基质胶包被96孔板，每孔加入细胞液100uL，3个复孔，培养1、2、4h后取出，加入CCK-8，检测450nm波长各孔吸光值。

1.3.8统计学方法-

SPSS22.0进行统计分析。计量资料用x ±s来表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1流式结果

流式结果显示分选前CD133表达率为1.5％左右，CD44表达率约为80.6％，使用免疫磁珠分选技术对磁珠进行分选，进行流式检测，检测结果示CD133-CD44-细胞纯度达99.52％左右，CD133+CD44+细胞组纯度达95.17％左右，如图1所示。

图1　（A）TU177；（B）CD133-CD44+；（C）CD133+CD44+；（D）CD133-CD44-

2.2增殖实验结果

如图2所示。

2.3迁移、侵袭、粘附、克隆实验结果

CD133+CD44+细胞迁移、侵袭、粘附、克隆数多于其它组细胞，CD133+CD44-细胞迁移、侵袭、粘附、克隆数大于CD133-CD44+细胞、CD133-CD44-细胞和TU177细胞，组间两两比较差异具有统计学意义（P＜0.00O1）。实验结果见表1。

图2　细胞增殖曲线

3　讨论

喉鳞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）源于喉黏膜上皮，居头颈部鳞癌第2位，约占全身恶性肿瘤6％。世界范围内喉鳞癌发病略有上升，且年轻化趋势逐渐显现［ 3］。喉鳞癌目前主要治疗方式以手术为主，辅以放疗，但其对放化疗敏感性较差。近30年来喉鳞癌5年生存率仍未有明显提升，患者一旦发生颈淋巴结转移，其生存率降低一半，是其5年内死亡的主要原因［4］。由于这些原因，进一步阐明喉癌的发病机制及其发病的生物学原因显的越来越重要。大量研究表明，肿瘤的发生、转移、复发和耐药等与肿瘤中的肿瘤干细胞有关。Zhou等研究认为，CD133可以作为喉癌干细胞标志物［5］。于丹［6］等认为CD44可以作为喉癌的特异性标志物。本研究中，我们联合CD133、CD44两个干细胞表面标志物，运用免疫磁珠分选技术对喉癌TU177细胞进行分组筛选，进行体外增殖、侵袭、迁移、粘附等能力分析。

表1　TU177、CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-迁移实验、侵袭实验、粘附实验、克隆实验的OD值

在细胞增殖实验中，CD133+CD44+细胞组增殖速度最快，第3天已经达到相对80％融合度，CD133+CD44-增殖数大于TU177、CD133-CD44+、CD133-CD44-组细胞。在细胞增殖方面我们也可以得出干细胞标志物CD133要强于CD44。

许多研究者认为，肿瘤干细胞具有较强的侵袭和转移能力。我们的研究结果表明，CD133+CD44+细胞确实具有更强的侵袭和迁移能力。通过细胞增殖实验发现CD133+44+细胞增殖能力也明显更强。粘附实验中发现，CD133+44+细胞在1小时内就可以迅速贴壁。克隆形成结果也提示，CD133+44+细胞具有更强的集落形成能力。所有这些特征都符合肿瘤干细胞的生物学特性。我们通过侵袭、迁移、粘附、克隆等实验的相互论证，更进一步证实了CD133+CD44+亚群细胞具有干细胞特性。综上所述，CD133+CD44+细胞组具有侵袭能力强、迁移快、粘附快、克隆能力强、增殖能力强等肿瘤干细胞特点，这两种细胞表面标志物可能作为喉肿瘤靶向治疗的靶点。但是实验中我们也发现，CD133-CD44-的细胞组也具有较弱的侵袭、迁移、克隆等能力，所以我们相信还有其他的干细胞标志物未被我们发现。因此，我们还需要进一步的研究、探讨。

参考文献

［1］ Monroe，M.M.，et al.，Cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.J Oncol.2011；2011:762-780.

［2］C.T.Jordan，M.L.Guzman，andM.Noble.Cancer stem cells.New England Journal of Medicine，2006，355（12）:1253-1261.

［3］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013.CA Cancer J Clin.2013，63（1）:11-30.

［4］Stransky N，Egloff AM，Tward AD，et al.The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.Science.2011.333（6046）:1157-60.

［5］Zhou L，Wei X，Cheng L，Tian J，Jiang JJ.CD133，one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.Laryngoscope.2007 Mar；117（3）:455-60.

［6］ 于丹，金春顺，赵胤，等，CD44+喉癌细胞的干细胞生物学特性初步研究.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志.2008，43：845-850.

Biological Characteristics of CD133+CD44+Cancer Stem Cells Sorting from Laryngeal Carcinoma Cell Line TU177

YANG Jun-ling1，2， GAO Wei1，2， WANG Jue2， FU Rong2， CHEN Bo2， LI Wei-yan2， WEN Shu-xin1，2， WANG Bin-quan1，2
（1.Department of Otolaryngology， Head & Neck Surgery， No.1 Hospital， Shanxi Medical University， Taiyuan， Shanxi，China.2.Shanxi Key Laboratory of Otorhinolaryngology Head and Neck Cancer， Key Institute and Laboratory of Otolaryngology affiliated with Shanxi Province， Taiyuan， Shanxi， China； 3.Department of Stomatology， No.1 Hospital，Shanxi Medical University， Taiyuan， Shanxi， China）

Abstract:Objective :Magnetic activated cell sorting was used to separate CD133+CD44+ cancer cells from laryngeal carcinoma TU177 cell line.Analysis the biological characteristics of these subpopulations .Methods :TU177 cells were subjected to magnetic activated cell sorting to obtain CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-cells.Evaluate the efficiency of magnetic separation by flow cytometry .Test cell proliferation，migration，invasion，adhesion，colony forming ability of the cells.Results:CD133+CD44+cells show higher proliferation，migration，invasion，adhesion，clone ability than other group（P＜0.0001）.Conclusions:TU177 cells can be serparated by Magnetic activated cell sorting effectively.CD133 is more powerful than CD44.Our study may provide evidence for target treatment of laryngeal cancer.

Keywords:Laryngeal cancer；CD133；CD44；TU177；Magnetic activated cell sorting ；Cancer stem cell

*基金项目：山西省基础研究计划自然科学基金（2014011039-5），山西省青年科技研究基金（2015021198），山西医科大学第一医院青年创新基金（YC1402）

作者简介：杨俊岭，男，山西医科大学第一临床医学院耳鼻咽喉科学硕士研究生在读，研究方向为头颈部恶性肿瘤侵袭转移

通讯作者：王斌全