间苯二酚苯酚洗剂微生物限度检查方法研究

翁　贤翁　嘉（.广东省中医院　广州　5005；.惠州市食品药品检验所　惠州　5600）



间苯二酚苯酚洗剂微生物限度检查方法研究

翁贤1翁嘉2（1.广东省中医院广州510105；2.惠州市食品药品检验所惠州516001）

摘要：目的：建立对间苯二酚苯酚洗剂进行微生物限度检查的方法。方法：采用常规法和培养基稀释法对细菌、霉菌及酵母菌进行回收率试验和方法学验证。结果：培养基稀释法对各菌的菌回收率均高于70%；控制菌验证试验中试验组结果均为阳性。结论：间苯二酚经稀释后抑菌活性可消除。采用培养基稀释法对间苯二酚苯酚洗剂的细菌、霉菌及酵母菌进行计数和控制菌检查，试验结果符合要求。建立的方法简便、可行、有效，可作为间苯二酚苯酚洗剂制剂的微生物限度检查方法。

关键词：间苯二酚苯酚洗剂微生物限度检查培养基稀释法间苯二酚方法验证

间苯二酚苯酚洗剂是用于治疗浅部真菌感染，如手足癣、体癣、股癣等的一种制剂。制剂中含有间苯二酚，间苯二酚是酚类衍生物的一种，属常用酚类消毒剂。然而在常温下，以间苯二酚800mg/L、1200mg/L、600mg/L的水溶液作用10min，分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的杀灭率均达100%［1］。因此，对于间苯二酚苯酚洗剂，进行微生物限度检查时，必须重点考虑如何消除间苯二酚本身抑菌性对实验结果的影响。笔者建立了有效的微生物限度检查法，并对间苯二酚苯酚洗剂的微生物限度检查进行了方法验证。

1　实验材料

1.1培养基：营养肉汤培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，改良马丁琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，甘露醇氯化钠琼脂培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，均购自中国药品生物制品检定所。

1.2验证用菌株：大肠埃希菌（菌种编号：［CMCC（B）44 102］；来源：广东省食品药品检验所）；金黄色葡萄球菌（菌种编号：［CMCC（B）26 003］；来源：广东省食品药品检验所）；枯草芽孢杆菌（菌种编号：［CMCC（B）63 501］；来源：广东省食品药品检验所）；白色念珠菌（菌种编号：［CMCC（F）98 001］；来源：广东省食品药品检验所）；铜绿假单胞菌（菌种编号：［CMCC（B）10 104］；来源：广东省食品药品检验所）；黑曲霉（菌种编号：［CMCC（F）98 003］；来源：深圳市药品检验所）。

2　菌液制备［2　］

2.1细菌菌液制备：大肠埃希菌：取第三代冻存管，放至室温解冻，接种至含营养肉汤培养基的培养皿中，36.0℃条件下培养24h；然后将培养物稀释105倍，即得实验用菌悬液。

金黄色葡萄球菌：取第三代冻存管，放至室温解冻，接种至含营养肉汤培养基的培养皿中，36.0℃条件下培养24h；然后将培养物稀释107倍，即得实验用菌悬液。

枯草芽孢杆菌：取第三代冻存管，放至室温解冻，接种至含营养肉汤培养基的培养皿中，36.0℃条件下培养24h；然后将培养物稀释106倍，即得实验用菌悬液。

铜绿假单胞菌：取第三代冻存管，放至室温解冻，接种至含营养肉汤培养基的培养皿中，36.0℃条件下培养24h；然后将培养物稀释107倍，即得实验用菌悬液。

注：稀释介质用0.9%无菌氯化钠溶液；实验用菌悬液要求浓度为每1mL 50～100cfu。

2.2霉菌菌液制备：取第三代冻存管，放至室温解冻，接种至含改良马丁培养基的培养皿中，26.5℃条件下培养48h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释106倍，即得实验用菌悬液，浓度为每1mL 50～100cfu。

2.3酵母菌菌液制备：取第三代冻存管，放至室温解冻，接种至含改良马丁琼脂斜面培养基的培养皿中，26.5℃条件下培养5d后，加入3mL的0.9%无菌氯化钠溶液（含0.05%吐温80），把斜面上的孢子洗脱下来。然后，用无菌吸管（管口带薄无菌棉花）将洗脱液吸至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液将洗脱液稀释105倍，即得浓度为每1mL含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

3　供试液的制备

间苯二酚苯酚洗剂（批号：011020）：由惠州市皮肤病防治研究所提供。取本品10mL，加入90mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，即得供试液。

4　预实验［3　］

用常规法对间苯二酚苯酚洗剂进行预实验，发现间苯二酚苯酚对枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌有较强的抑制作用，对黑曲霉抑制作用较弱。因此选择培养基稀释法再进行试验。

5　验证试验

5.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：

5.1.1试验条件：细菌用计数方法进行验证：验证菌株为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及枯草芽孢杆菌，细菌培养温度为32.5℃。

霉菌及酵母菌用计数方法进行验证：验证菌株为白色念珠菌、黑曲霉，培养温度为26.5℃。

在确定细菌、霉菌及酵母菌的验证方法后，重复三次独立平行试验进行验证，考察各组菌的回收率。

5.1.2试验分组与步骤（如表1）：

试验组：各取供试液0.2mL、0.5mL置平皿（90mm）中，分别加入1mL菌悬液。立即注入相同体积的琼脂培养基，待其凝固后，将平皿倒置，再培养24h，记录下各平皿的菌落数，做两次平行试验。

菌液组：取1mL菌悬液加入平皿，立即注入琼脂培养基，待其凝固后，将平皿倒置，再培养24h，记录下各平皿的菌落数，做两次平行试验。

供试液对照组：各取供试液0.2mL、0.5mL，不加菌液，其他操作条件同试验组，记录样品本底菌落数。

5.1.3计算各试验菌株的回收率：记录各试验组的平均菌落数，然后按照以下方法进行计算：

菌株回收率（%）=［（试验组-供试液对照组）/菌液组］× 100%。各试验菌株的回收率如表1、表2。

表1　各菌株回收率（%）培养基稀释法（0.5mL/皿）

表2　各菌株回收率（%）培养基稀释法（0.2mL/皿）

5.1.4试验结果：表1、2数据表明，采用培养基稀释法（0.2mL/皿），大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌3次平行试验的回收率均达到70%以上。采用培养基稀释法（0.5mL/皿），白色念珠菌和黑曲霉3次平行试验的回收率也均达到70%以上。因此，可采用0.2mL/皿的培养基稀释法，检查间苯二酚苯酚洗剂的细菌数；可采用0.5mL/皿的培养基稀释法，检查霉菌及酵母菌数。

5.2控制菌检查法的验证：间苯二酚苯酚洗剂为局部给药制剂，药典的控制菌检查要求检验金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌［2］。

5.2.1金黄色葡萄球菌检查法的验证：常规法：取供试液10mL，加入100mL的营养肉汤增菌培养基中，再加入1mL金黄色葡萄球菌菌悬液，按金黄色葡萄球菌的检查法，进行控制菌检查。

培养基稀释法：取供试液10mL，加入200mL的营养肉汤增菌培养基中，再加入1mL金黄色葡萄球菌菌悬液，按金黄色葡萄球菌的检查法，进行控制菌检查。

结果见表3。

5.2.2铜绿假单胞菌检查法的验证：常规法：取供试液10mL，加入100mL的胆盐乳糖增菌培养基中，再加入1mL铜绿假单胞菌菌悬液，按铜绿假单胞菌的检查法，进行控制菌检查。

培养基稀释法：取供试液10mL，加入200mL的胆盐乳糖增菌培养基中，再加入1mL铜绿假单胞菌菌悬液，按铜绿假单胞菌的检查法，进行控制菌检查。

结果见表3。

表3　控制菌验证结果

5.2.3试验结果：表3数据表明，两种菌的培养基稀释组均检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，表明间苯二酚苯酚洗剂可用培养基稀释法（200mL）进行控制菌检查。

6　讨论

本研究采用培养基稀释法探讨间苯二酚苯酚洗液多个浓度对细菌、霉菌及酵母菌限度检查。从实验回收率数据分析得，间苯二酚苯酚洗剂细菌计数可采用0.2mL/皿的培养基稀释法，霉菌和酵母菌计数可采用0.5mL/皿的培养基稀释法。间苯二酚苯酚洗剂可用培养基稀释法（200mL）进行控制菌检查验证，该实验方法合理简便。因此本方法可以作为间苯二酚苯酚洗剂的微生物限度检查法。

参考文献

［1］刘继敏，赵勇，高贵军.间苯二酚消毒剂杀菌效果观察［J］.中国实用医药，2005，22（3）：309.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部［S］.2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录107-116.

［3］林丽英，湛文清，饶春意.野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立［J］.中药材，2006，29（3）：299-302.

Method research of microbial limit test in resorcinol phenol lotion

Xian Weng1Jia Weng2（1.Guangdong Province Hospital of TCM，Guangdong，Guangzhou 510105；2.Food and Drug Administration of Huizhou District，Guangdong 516001）

Abstract：Objective：To establish a method for resorcinol phenol lotion microbial limit test. Methods：Used the conventional microbial species method and the medium dilution microbial species detecting method by test the recovery of each test strains. Results：The recoveries were more than 70%by culture medium diluting method. Pathogenic bacteria in the test group to verify the test results were positive. Conclusion：Resorcinol can eliminate their antibacterial activity after dilution. Culture medium diluting method was used with counts bacterial，mold and yeasts，pathogenic bacteria test. The test results meet the requirements. The method is simple，effective and feasible and can be used for microbial limit test of Resorcinol phenol lotion.

Key words：Resorcinol phenol lotion Microbial limit test Culture medium diluting method Resorcinol Method verification.

中图分类号：R927.11

文献标识码：B

文章编号：1672-8351（2016）06-0124-02