大漂提取物抑制铜绿微囊藻的试验研究

吴 湘吴 昊钟 斌叶金云（.湖州师范学院生命科学学院，浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，湖州 33000； .湖州市环境保护监测中心站，湖州 33000）

大漂提取物抑制铜绿微囊藻的试验研究

吴 湘1吴 昊2钟 斌1叶金云1
（1.湖州师范学院生命科学学院，浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，湖州 313000； 2.湖州市环境保护监测中心站，湖州 313000）

摘要：为了确定高效脱氮除磷的水生漂浮植物大漂的主要化感活性物质，本文通过乙醇超声波提取获得大漂的化感粗提物，利用溶剂萃取法从粗提物中分离得到4种能抑制铜绿微囊藻（FACHB-911）生长的化感萃取物，当其浓度均为0.1 g/L时共培养5d后抑藻率分别为40%、69%、40%、35%。将抑藻率最高的化感萃取物通过酸性氧化铝柱层析法进一步分离纯化，分离得到4组抑藻作用较弱的（5d后抑藻率分别为12%、11%、33%、41%）和1组抑藻作用较强的化感层析流分（5d后抑藻率高达80%）。将抑藻作用最强的化感层析流分通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法进行成分检测，发现大漂提取物中含有对甲苯磺酸甲酯、硬脂酸酰胺两种具有化感潜力的化合物。

关键词：大漂； 提取分离； 化感作用； 铜绿微囊藻； 生长抑制

近年来，水生植物化感作用已广泛应用于富营养化水体藻类控制领域，相关研究受到国内外专家的普遍关注［1—3］。抑藻水生植物普遍存在于水体中，容易获得、栽种或移植，且数量丰富。它们一方面能吸收水体中的营养物质，为水中营养物质提供输出的渠道； 另一方面它们能够分泌抑制藻类生长的化感物质，起到修复、净化富营养化水体的作用［4，5］。化感物质是水生植物生长过程中产生的次生代谢物质，一般能在自然条件下降解，不会在生态系统中长期积累，生态安全性好［6，7］。因此通过研究开发高效专一的化感物质除藻剂，可为湖泊富营养化的生态治理探索切实可行的方法。

目前利用水生植物化感作用控制藻类，主要集中于沉水植物［8—10］，挺水植物［11，12］，而对漂浮植物的研究多集中于凤眼莲［13］、浮萍［14］等较常见的种类。因此本实验拟选用的研究对象是具有高效脱氮除磷的漂浮栽培植物大漂［15］（Pistia stratiotes Linn.），大漂系天南星科大漂属植物，又名大藻、浮萍、水浮莲。水浮莲味淡微辛，性平，无毒（根有微毒），既可以作为一种美化园林景观的植物，也可以作为家畜家禽的优选饲料。而铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）作为蓝藻水华最常见的优势种，对其进行有效抑藻物质的开发和研究非常有必要。因此，利用大漂化感物质控制铜绿微囊藻生长并加以妥善处理和资源化利用，既可达到有效防控蓝藻水华污染的目的，又能产生一定的经济效益，从而实现水污染治理的良性循环。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大漂:采自本地乡村河道，挑选生长健康、大小均一的植株进行预培养。

铜绿微囊藻（FACHB-911）:购自中国科学院水生生物研究所。实验前采用BG-11培养基预培养铜绿微囊藻，使之处于对数增长期。

1.2 试验设置与方法

大漂化感粗提物的制备 称取50 g大漂（洗净后60℃，干燥48h，粉碎至50目），放置于烧杯中，加入100 mL无水乙醇进行超声波提取。提取结束后，用0.22 μm有机系滤膜过滤杂质，后通过旋转蒸发（100 r/min，85℃）除去溶剂，得到浸膏。

大漂化感粗提物的萃取分离 提取得到的浸膏依次用乙酸乙酯、正己烷、石油醚（30—60℃）萃取，每种溶剂各萃取3次，合并萃取液，分别得到乙酸乙酯相（Ethyl acetate phase，简写EAP）、正己烷相（n-hexane phase，简写NHP）、石油醚相（Mineral ether phase，简写MEP）、水相（Water phase，简写WP），然后将各有机相和水相旋转浓缩，再用0.22 μm微孔滤膜进行过滤，去除固体颗粒物，得到纯净浓缩液。各浓缩液用二甲基亚砜（DMSO）定容（DMSO浓度小于1%对铜绿微囊藻生长无影响［16］），在无菌条件下，通过0.22 μm有机系滤膜除去微生物于4℃冰箱保存备用。

大漂最佳抑藻化感萃取相的选择 叶绿素a检测法:在无菌条件下，培养皿中倒入含2%琼脂的BG-11培养基，冷却后切割成31 mm的小圆，放入一张30 mm的滤纸，于滤纸中央滴加200 μL处于对数生长期的藻液，加入一定量的已定容好的有机相和水相，浓度为0.10 g/L密封。在温度为25℃，光照强度为40—60 μmol/（m2·s），光暗比为14h∶10h的人工气候室中培养，3d后测定滤纸片上叶绿素a［17］的含量，每个提取物做3个平行； 培养液检测法:采用培养液法，培养液混合体积为100 mL。其中包括一定体积的处于对数生长期的藻液及一定体积的有机相和水相，每个萃取物设定3个平行，在温度为25℃，相对湿度为75%，光照强度为40—60 μmol/（m2·s），光暗比为14h∶10h的人工气候室中培养，每隔两天计数1次。采用显微镜计数法测定培养液的藻细胞密度变化。

大漂最佳抑藻化感萃取相的分离提纯 将大漂最佳抑藻化感萃取物进行柱层析法分离:采用Φ=26 mm，h=300 mm 层析柱，以40 g 酸性氧化铝（100—200目）干法装柱，加入待分离液1 mL（含有100 mg样品），进行阶段洗脱。每种洗脱剂体积都为40 mL，洗脱剂种类分为:W1（石油醚∶乙酸乙酯= 100∶0，体积比，以下均如此）、W2（石油醚∶乙酸乙酯=70∶30）、W3（石油醚∶乙酸乙酯=50∶50）、W4（石油醚∶乙酸乙酯=30∶70）、W5（石油醚∶乙酸乙酯=0∶100）。每种洗脱剂加入层析柱后可以收集到一组洗脱流分，每组流分都进行蒸干、称重，用一定量的DMSO定容，将每组流分的DMSO溶液进行编号（W1、W2、W3、W4、W5）。

大漂最佳抑藻化感层析流分的确定 将各层析流分（W1、W2、W3、W4、W5）分别以一定的浓度投放到100 mL的铜绿微囊藻培养液中，每个流分和对照组均设3个平行。将上述培养混合液置于温度25℃，相对湿度75%，光照强度40—60 μmol/（m2·s），光暗时间比为14h∶10h的人工气候箱中培养，每隔两天计数一次，以确定其抑藻活性。W0为空白组，不添加任何层析流分。根据藻密度的变化，确定对铜绿微囊藻生长抑制作用最好的大漂化感层析流分。同时利用含摄像装置的倒置显微镜（Motic）观察铜绿微囊藻在最佳抑藻化感层析流分影响下细胞形态的变化。

大漂最佳抑藻化感层析流分组成的初步鉴定

利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法对大漂最佳抑藻化感层析流分进行主要组成的初步检测鉴定，从而明确大漂提取物中的有效抑藻成分。

1.3 数据统计与分析

根据藻密度计算大漂化感萃取相和层析流分对铜绿微囊藻的相对抑制率，计算公式为:

IR（%）=（1 - N/N0）× 100%

式中IR 为相对抑制率，N 为处理组的藻密度（个/ mL），N0为空白对照组藻密度（个/mL）。所有样品平行测定3次，结果取其均值。数据采用Excel2007软件进行统计、分析和制图。

2 结果与讨论

2.1 大漂最佳抑藻化感萃取相的选择

图 1 大漂化感萃取相对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

图 1表明大漂4种化感萃取相对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响，图 2为加入各萃取相后铜绿微囊藻的藻密度及其相对抑制率的变化。由图 1可知，共培养3d后各组大漂化感萃取相处理组中，藻细胞叶绿素a含量均出现不同程度的下降，其中乙酸乙酯相处理组的叶绿素a含量下降最多，第3天比第0天下降了66%。正己烷相处理组的叶绿素a含量下降最少，但也达到了38%，可见各种大漂抑藻化感萃取相对铜绿微囊藻叶绿素a含量都有较好的削减作用，而叶绿素a含量主要受光合作用的影响，说明大漂抑藻化感萃取相可以通过影响藻细胞的光合作用，从而抑制藻细胞的正常生长。

根据图 2可知，大漂的4种化感萃取相对铜绿微囊藻的细胞增殖均有一定的抑制作用，藻密度虽有增加但是明显低于空白对照组，第3天各组的IR%达到37%—44%，且各组间差异不显著。而在第5天各萃取相的IR%相差较为明显，其中乙酸乙酯相对藻细胞生长的抑制作用最强，IR%达到70%，而其余3组的IR%相差不大，介于35%—40%。综合图 1和图 2可以发现，大漂提取物的乙酸乙酯萃取相对铜绿微囊藻叶绿素a和藻密度的抑制效果均为最佳，表现出较好的抑藻活性，但是其中的有效抑藻化感成分仍需进一步分离纯化。

2.2 大漂最佳抑藻化感层析流分的选择

大漂化感粗提物中抑藻作用最强的乙酸乙酯萃取相经酸性氧化铝柱层析可以得到5个流分，各流分均以一定的浓度用于抑藻活性检测。图 3为投加各层析流分后铜绿微囊藻的生长及抑制率曲线。由图 3可知，流分W2对藻细胞生长基本无影响，流分W1、W3、W4和W5均具有抑藻活性。流分W1在第2至第4天内表现出一定的抑藻作用，但是第5天藻细胞即开始恢复正常生长，其原因可能是流分W1中的有效抑藻物质随着时间逐渐被降解，失去了抑藻活性。而流分W4和W5的抑藻效果在实验期间表现较好，第5天的IR%分别可达45%和81%，尤其是流分W5，因此可确定其为大漂最佳抑藻化感层析流分，但是W5的具体组成仍有待进一步的分析和鉴定，以明确大漂提取物中的有效抑藻化感成分。

2.3 大漂最佳抑藻化感层析流分对藻细胞形态的影响

洪喻等［16］研究发现，铜绿微囊藻在投加芦竹化感物质后启动了多种拮抗途径应对化感物质的胁迫，譬如藻细胞空洞化、色素减褪、细胞聚团、体积减小等。而根据本实验的研究结果（图 4A）同样发现，在大漂最佳抑藻化感层析流分的胁迫下，铜绿微囊藻的藻细胞开始抱团缩小体积，推测这是由于藻细胞受到刺激，自发的一种自我保护机制。铜绿微囊藻细胞通常在人工培养条件下主要是以单细胞形式存在；而在自然条件下则主要是以群体形式存在［18］。野外采集到的微囊藻细胞经过纯化后由群体型转变为单细胞［19］。当微囊藻以单细胞存在时，在外界的环境的胁迫作用下导致藻细胞活性降低或死亡，而群体藻细胞则能抵御抑制作用，保持活力。因此，当化感物质作用于微囊藻细胞时，个体细胞聚集成群来抵御化感物质的抑制作用。而从图4B中还能看出，在大漂最佳抑藻化感层析流分的作用下，铜绿微囊藻的藻细胞出现破碎现象，其破碎原因还有待进一步研究。

图 2 大漂化感萃取相对铜绿微囊藻生长（藻密度）及抑制率的影响

图 3 大漂抑藻化感层析流分对铜绿微囊藻生长（藻密度）及抑制率的影响

图 4 大漂最佳抑藻化感层析流分对铜绿微囊藻藻细胞形态的影响（A.抱团； B.破壁）

2.4 大漂最佳抑藻化感层析流分组成的初步鉴定

根据图 5分析，抑藻效果最佳的W5层析流分通过GC-MS方法分析鉴定，检测出其中含有多种化合物。但是由于样品纯度不够高，导致结果仅能鉴定出两种主要的化合物，即22.9min时检测出的对甲苯磺酸甲酯和32.105min时检测出的硬脂酸酰胺。已有研究表明酯类酰胺类为常见植物化感物质类型［20］，故推测大漂层析流分中检出的对甲苯磺酸甲酯和硬脂酸酰胺可能具有植物化感作用，而其余成分还需进一步地对样品进行分离纯化和检测分析以获得确认。

图 5 GC-MS法检测大漂最佳抑藻化感层析流分图谱

3 结论

（1）利用不同有机溶剂对大漂粗提物依次进行萃取，结果表明，乙酸乙酯萃取相对铜绿微囊藻的生长抑制作用最明显，5d后其抑藻率高达69%，由此可确定其为大漂最佳抑藻化感萃取相。

（2）将乙酸乙酯萃取相经酸性氧化铝柱层析法分离得到5个层析流分，其中W5流分对铜绿微囊藻的生长抑制作用最强，5d后其抑藻率高达80%，由此可确定其为大漂最佳抑藻化感层析流分。

（3）大漂最佳抑藻化感层析流分中含有强极性的抑藻物质，通过GC-MS法检测发现，大漂提取物中含有对甲苯磺酸甲酯和硬脂酸酰胺两种具有抑藻化感潜力的组分，其余成分有待进一步分离纯化和分析鉴定。

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EXPERIMENTAL STUDY ON THE INHIBITION EFFECT OF EXTRACTS FROM PISTIA STRATIOTES LINN.ON THE GROWTH OF MICROCYSTIS AERUGINOSA

WU Xiang1，WU Hao2，ZHONG Bin1and YE Jin-Yun1
（1.Zhejiang Province Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development，College of Life Sciences，Huzhou University，Huzhou 313000，China； 2.Huzhou Environmental Protection Monitoring Centre Station，Huzhou 313000，China）

Abstract:The current study obtained four different allelopathic crude extracts from Pistia stratiotes Linn，a aquatic floating plant with higher efficiency on nitrogen and phosphorus removal，using ethanol ultrasonic extraction.These four，allelopathic extracts（0.1 g/L）inhibited the growth of Microcystis aeruginosa（FACHB-911）for 40%，69%，40% and 35% after 5 days treatment，respectively.Extracts were further purified through the method of acidic alumina column chromatography separation，which had inhibition rates 12%，11%，33 and 41% after 5 days treatment，respectively.Interestingly，one group of allelopathic fraction had 80% inhibition rate after 5 days treatment.The results of gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）analysis revealed that the extracts from P.stratiotes mainly contained two antialgal compounds including P-toluene sulfonic acid methyl ester and stearic acid amide.

Key words:Pistia stratiotes Linn.； Extraction and separation； Allelopathy； Microcystis aeruginosa； Growth inhibition

中图分类号：X 52； Q 946

文献标识码：A

文章编号：1000-3207（2016）03-0547-05

doi:10.7541/2016.73

收稿日期：2015-05-11；

修订日期：2015-11-03

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（21207036）； 湖州市生态文明先行示范区科技专项重点项目（2014ZD2019）； 浙江省自然科学基金青年科学基金项目（LQ12B07001）； 浙江省重大科技专项重大农业项目（2014C02011）资助［Supported by National Natural Science Foundation of China（21207036）； Key Project of Science and Technology Special Projects on Demonstration Area of Ecological Civilization of Huzhou City（2014ZD2019）； Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LQ12B07001）；Significant Agricultural Projects of Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province（2014C02011）］

通信作者：吴湘（1981—），女，浙江东阳人； 博士，副教授； 主要从事利用植物化感作用控制藻类研究。E-mail:wwxx1981@126.com