人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选

刘凯玉，蒋 维，王瑞娜，吴家雪，党永军

(1. 复旦大学 生命科学学院， 上海200000; 2. 复旦大学 基础医学院， 上海 200032)

人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选

刘凯玉1，蒋 维2，王瑞娜2，吴家雪1，党永军2

(1. 复旦大学 生命科学学院， 上海200000; 2. 复旦大学 基础医学院， 上海 200032)

摘要构建并鉴定人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体，筛选CARABIN过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SU-DHL-6的稳定细胞株。通过设计Carabin上下游引物，用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-cGFP-CARABIN，将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent 共转染HEK293T细胞制备病毒，用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后，用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞，Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-cGFP-CARABIN慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后，荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%，筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到CARABIN-GFP融合蛋白表达。成功构建了Carabin过表达慢病毒载体并筛选出了CARABIN-GFP稳定表达的细胞株。

关键词CARABIN; 过表达; 稳定细胞株; 弥散性大B淋巴瘤

同源重组是指发生在姐妹染色单体间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子间或分子内的重新组合[1,2]。我们利用Vazyme公司的同源重组试剂盒，可以高效快速地构建克隆。慢病毒(lentivirus)对非分裂期和分裂期的细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，使宿主细胞持久地表达外源基因[3，4]。慢病毒能成为实现基因长期稳定高效表达的理想载体[5]。慢病毒载体来源于多种严重致病性病毒，实验操作时具有一定的危险性，需要采取一些防护措施以确保其安全性[6，7]。在细胞内过表达外源基因，是通过将目的基因克隆到载体上，转染进入细胞，目的基因在表达载体的启动下启动表达。

本实验室过表达的慢病毒载体记作pLENTI-cGFP，属于二代慢病毒载体，它含有EF1α启动子，多克隆位点的C端带有增强型绿色荧光蛋白( green fluorescent protien， GFP)标签，表达该蛋白能发出绿色荧光，其产生荧光无需底物或辅因子，发色团是该蛋白质一级序列固有的[8]，可以作为筛选标记。流式细胞分选仪(Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS)广泛应用于细胞的分离纯化，可以根据颗粒特性进行分选，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大等特点[9]。目前，流式细胞分选技术已应用于外周血细胞[10]。

CARABIN是TBC1蛋白家族的成员，前期研究表明，CARABIN 在脾脏和外周血淋巴细胞中表达，并负调控T细胞抗原受体(T cell antigen receptor， TCR)信号通路。进一步研究发现CARABIN是钙依赖磷酸酶Calcineurin的内源性抑制因子。除此之外，它还通过其Ras GAP活性抑制Ras信号通路[11]。CARABIN对Calcineurin和Ras通路的调控是因为通过直接与Ras以及Calcineurin相互作用而实现的。另外，CARABIN也通过靶向抑制Rab35导致胞内囊泡积聚从而损害exosome的分泌[12]；CARABIN还可以通过同样的机制负调控B细胞的BCR信号通路，抑制CARABIN的表达可以加快B细胞的早期应答[13]。最近，在敲除CARABIN的小鼠中发现CARABIN与心肌肥厚有关，也是通过抑制Calcineurin、Ras和Ca2+/钙依赖性蛋白激酶2信号通路防止心肌肥厚[14]。我们实验室的前期研究发现SU-DHL-6细胞中CARABIN的表达水平较低，为了进一步研究CARABIN在B淋巴瘤细胞中的作用，我们构建CARABIN的过表达慢病毒载体，并筛选到CARABIN稳定表达的SU-DHL-6细胞株， 这为后续深入揭示CARABIN与肿瘤发生发展的关系以及其分子作用机制奠定了实验基础。

1材料与方法

1.1 材料

质粒小提试剂盒(Tiangen)、DNA 凝胶回收试剂盒(Tiangen)；One Step Cloning kit(Vazyme)、BamHI、MLUI限制性内切酶(New England Biolabs)；胎牛血清、DMEM高糖培养基、1 640培养基(Gibco)；PEI Transfection Reagent转染试剂；Carabin引物序列由上海生工生物工程有限公司合成；DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成；流式细胞分选仪由复旦大学生命科学院流式细胞仪平台提供并操作；质粒pMD2.G、psPAX2、HEK293T细胞、SU-DHL-6细胞、大肠杆菌XL10感受态细胞由实验室保存。过表达载体由实验室改造得来，记作pLENTI-cGFP。

1.2方法

1.2.1 目的基因Carabin引物序列的设计根据Carabin的编码序列(coding sequence，CDS)设计一段含有同源臂的引物(表1)，通过在引物5′端引入线性化过表达载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′最末端分别带有和线性化过表达载体两末端对应的完全一致的序列。表1中小写字母，分别为线性化过表达载体上的BamHI和MLUI酶切位点，黑体表示同源臂。

表1 目的基因Carabin引物序列

1.2.2 目的基因CarabinPCR扩增，过表达载体pLENTI-cGFP线性化扩增的模板为实验室原有的带有CARABIN-Flag 的质粒。建立50 μL的PCR反应体系：2×Phanta SF buffer 25 μL；Phanta SF高保真酶 1 μL, 10 mmol/L dNTP 1.0 μL；10 μmol/L上游引物1.5 μL；10 μmol/L下游引物1.5 μL；模板1 μL；DMSO 2.5 μL；补足ddH2O至50 μL。 PCR反应条件为95℃预变性5 min；94℃变性20 s， 60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后割胶取目的条带，用试剂盒回收后待用。将pLENTI-cGFP载体用BamH I和MLUI进行双酶切，酶切反应体系为：BamH I 1 μL,MLUI 1 μL, 10×NEB Buffer3.1 2 μL, 2 μg pLENTI-cGFP质粒7 μL, 补足ddH2O至20 μL。37℃酶切3 h。酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，经试剂盒回收目的条带后待用。

1.2.3Carabin构建过表达载体pLENTI-cGFP，鉴定克隆。将回收的PCR产物和酶切的线性化载体同源重组，反应体系为：Carabin扩增产物1 μL(约25 ng)，pLENTI-cGFP酶切产物1 μL(约50 ng)，5×CEⅡ Buffer 4 μL， ExnaseTMⅡ 2 μL， 补足ddH2O至20 μL。37℃反应30 min。反应完成后立即将反应管置于冰上5 min，然后进行重组产物转化、涂板。用热激法转化大肠杆菌XL10感受态细胞。将转化细胞均匀涂布于含有100 mg/L氨苄的LB固体培养基上。37℃ 15 h后，挑取单克隆到含有相同氨苄抗性的LB液体培养基，在37℃摇床上培养15 h。用质粒小提试剂盒抽提质粒。用BamHI和MLUI双酶切初步鉴定，阳性结果送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，测序引物为pEGFP-N3和CarabinPCR扩增的上游引物。1.2.4 包装pLENTI-cGFP-CARABIN病毒颗粒HEK293T细胞常规培养。第1天在6孔板中接种1×106个HEK293T细胞，使其过夜后能融合70%～80%。第2天将pLENTI-cGFP-CARABIN重组质粒和空载体质粒(作为阴性对照)与包装系统质粒 psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞，三者的比例为pLENTI-cGFP-CARABIN∶psPAX2∶pMD2.G为3∶2∶1，转染72 h后收集上清液，离心(5 000 r/min, 5 min, Thermo)，上清液再用0.45 μm的过滤器过滤。收获的病毒液-80℃保存待用。

1.2.5 筛选CARABIN稳定表达的细胞株接种5×104个SU-DHL-6到6孔板中，加入纯化后的病毒-1640混合液，离心1 000 r/min，2 h，使病毒和细胞充分接触，提高感染效率。然后将细胞在 37℃、5%的 CO2培养箱中培养过夜；第3天更换新鲜的1 640培养基；感染后4 d，荧光显微镜下观察各孔中绿色荧光蛋白GFP的荧光表达情况。将感染过的细胞经流式分选仪筛选出GFP阳性表达的稳定细胞株。

1.2.6 Western Blot检测CARABIN蛋白和GFP蛋白的表达收取相同量的过表达CARABIN大细胞和阴性对照(negative control，NC)细胞，用PBS(含有蛋白酶抑制剂)洗3次，4℃下1 000 r/min离心5 min，加入200 μL的2×SDS sample buffer(含有1%Triton×100)裂解细胞，提取阳性细胞的总蛋白，煮沸变性后用10%SDS-PAGE电泳分离，100V×1.5 h湿法转移至硝酸纤维素膜。转载标本蛋白的硝酸纤维素膜浸入含5%脱脂奶粉的PBST(含0.1%Tween-20)，室温封闭1 h，加入一抗(兔源的人CARABIN抗体、β-actin抗体、GFP抗体，1∶1 000)，4℃振荡孵育过夜，PBST洗涤5 min×3次后，加入HP标记的山羊抗鼠二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，PBST充分洗涤后，化学发光法检测膜上的信号。其中β-actin作为内源性参照。

2结果与分析

2.1 PCR扩增Carabin片段

以质粒CARABIN-Flag为模板，用Carabin上游引物和Carabin下游引物(表1)，经PCR扩增获得1 341 bp的目的条带(图1)。

图1 Carabin的PCR扩增电泳结果

1: DL 1000 DNA marker；2:CarabinPCR amplification

2.2 pLENTI-cGFP-CARABIN载体构建与鉴定

对慢病毒载体pLENTI-cGFP双酶切、凝胶回收后按重组酶说明书上进行同源重组(图2)。转化后挑取单克隆抽提质粒，酶切鉴定为阳性的克隆送至上海生工生物工程有限公司测序，确保Carabin序列的正确性。阳性克隆测序结果与Carabin序列比对相一致(图3)。

图2 pLENTI-cGFP-CARABIN重组质粒的构建

图3 阳性克隆pLENTI-cGFP-CARABIN的测序图谱

(Due to the long gene sequences, here only shown partially sequence including the initiation codon)

2.3 pLENTI-cGFP-CARABIN病毒颗粒包装

pLENTI-cGFP-CARABIN重组质粒和空载体质粒pLENTI-cGFP与包装病毒系统质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞，转染3 d后收集上清液病毒颗粒。

2.4 筛选pLENTI-cGFP-CARABIN过表达的稳定细胞株

pLENTI-cGFP-CARABIN慢病毒过表达载体及空载体pLENTI-cGFP病毒颗粒侵染SU-DHL-6细胞后72 h在荧光显微镜下观察到细胞带有绿色荧光(图4)。进一步将感染过的细胞传代，观察细胞生长情况。两周后，用流式分选仪筛选出带有绿色荧光的过表达CARABIN的稳定细胞株(图5)。

图4 荧光显微镜检测病毒侵染的SU-DHL-6细胞(100，图中标尺为100 μm)

图5 流式分选仪获取的GFP表达阳性细胞的散点图

2.5 Western Blot检测CARABIN-GFP融合蛋白的表达

Western Blot检测结果(图6)表明， 成功获得过表达CARABIN的SU-DHL-6稳定细胞株，CARABIN抗体和GFP抗体检测的均为CARABIN-GFP融合蛋白，大小约为76 ku。内源性参照β-actin基本一致，融合蛋白在CARABIN过表达的细胞株中有表达，而在转染空载体的阴性对照中没有表达。

图6 Western Blot 检测各组CARABIN和GFP蛋白表达

NC: negative control; 1: over-expression of CARABIN

3讨论

B淋巴瘤可分为霍奇金氏和非霍奇金氏B淋巴瘤，在临床上更以非霍奇金氏弥散性大B淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphomas，DLBCL)最为常见。DLBCL较容易治愈，但有大约30%的患者仍会复发或在初次治疗后发展为难治型疾病[15]，因此需要对其发病机理进行深入探讨。

CARABIN是TBC1家族蛋白的成员，它在B淋巴瘤细胞中抑制Calcineurin、Ras/Erk、Toll-like Receptor 9(TLR9)/BCR通路[13]，该信号通路在细胞分化、增殖、凋亡以及疾病的发生发展中起着重要的作用。此外，B淋巴细胞异常活化是自身免疫病发病的核心，核因子B(NFκB)和活化蛋白1(AP-1)信号通路的激活能促进B细胞活化、增殖和分化，CARABIN参与调控这些通路[13]，而SU-DHL-6属于依赖BCR信号通路且低表达NFκB的DLBCL细胞[16]，前期研究发现CARABIN在SU-DHL-6细胞中的表达量较低，因此将CARABIN在B淋巴瘤细胞SU-DHL-6中过表达，与转入相应空载体的细胞对比，可分析CARABIN的表达增加，改变了B淋巴瘤细胞的哪些生物学行为或引起了哪些信号通路的改变等。从而有助于初步描述CARABIN在B淋巴瘤中的功能，并提示其在肿瘤发生发展过程中的作用及其可能参与的信号转导通路。

慢病毒载体包含有包装、转染、稳定和整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的重要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒和HEK293T细胞的协助作用下，被包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染目的细胞，实现外源基因在目的细胞中表达。因为B淋巴瘤细胞为悬浮细胞，其转染效率较低，成为研究工作的限速步骤，所以我们采用慢病毒侵染的方法来解决这一问题。

本研究采用同源重组的方法构建了CARABIN过表达慢病毒载体，该方法简单快捷，目的载体带有绿色荧光蛋白标签，可以用作筛选标记。构建的克隆测序成功后，在HEK293T细胞中包装病毒颗粒，收集病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞，通过流式分选仪筛选GFP表达阳性细胞，从而获得CARABIN稳定表达的细胞株，为进一步研究分析CARABIN在B淋巴瘤细胞中的作用机制奠定了基础。

参考文献：

[1]刘 萍, 夏立秋, 胡胜标, 等.外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达[J].微生物学报, 2008, 48(5):661-666.

[2]SAN FILIPPO J, SUNG P, KLEIN H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination[J]. Annual Review of Biochemistry, 2008, 77:229-257.

[3]NALDINI L, BLÖMER U, GALLAY P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science, 1996, 272(5259): 263-267.

[4]MIYOSHI H, SMITH K A, MOSIER D E, et al. Transduction of human CD34+cells that mediate long-term engraftment of NOD/SCID mice by HIV vectors[J]. Science, 1999, 283(5402): 682-686.

[5]COORAY S, HOWE S J, THRASHER A J. Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning[J]. Lancer, 2012, 507:29-57.

[6]KAFRI T, VAN PRAAG H, OUYANG L, et al. A packaging cell line for lentivirus vectors[J]. J Virol, 1999, 73(1): 576-584.

[7]MIYOSHI H, BLÖMER U, TAKAHASHI M, et al. Development of a self-inactivating lentivirus vector[J]. J Virol, 1998, 72(10): 8150-8157.

[8]CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J]. Science, 1994, 263(5148):802-805.

[9]石亚萍, 种银保, 王 晴.高端流式细胞分选仪的选型评价[J] .医疗卫生装备, 2010, 31(10):122-124.

[10]WANG D, ZHENG M, LEI L, et al. Tespal is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling[J]. Nat Immunol, 2012, 13(6):560-568.

[11]PAN F, SUN L, KARDIAN D B, et al. Feedback inhibition of calcineurin and ras by a dual inhibitory protein carabin [J]. Nature, 2007, 445(7126): 433-436.

[12]HSU C, MOROHASHI Y, YOSHIMURA S, et al. Regulation of exosome secretion by Rab35 and its GTPase-activating proteins TBC1D10A C[J]. J Cell Biol, 2010, 189(2): 223-232.

[13]SCHICKEL J N, PASQUALI J L, SOLEY A, et al. Carabin deficiency in B cells increases BCR-TLR9 costimulation-induced autoimmunity[J]. EMBO Mol Med, 2012, 4(12): 1261-1275.

[14]BISSERIER M, BERTHOUZE-DUQUESNES M, BRECKLER M, et al. Carabin protects against cardiac hypertrophy by blocking calcineurin, ras, and ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II signaling[J]. Circulation, 2015, 131(4): 390-400.

[15]CHEN L F, MONTI S, JUSZCZYNSKI P, et al. SYK inhibition modulates distinct PI3K/AKT dependent survival pathways and cholesterol biosynthesis in diffuse large B cell lymphomas[J]. Cancer Cell, 2013, 23(6)： 826-838.

[16]FRIEDBERG J W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2011, 2011(1):498-505.

Construction of lentivirus expression vector of human CARABIN and screening of cell line stably expressing CARABIN

LIU Kai-yu1, JIANG Wei2, WANG Rui-na2, WU Jia-xue1, DANG Yong-jun2

(1. School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200000;2. School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China)

AbstractionThe aim of this study is to construct the lentivirus expression vector of human CARABIN and to screen the Diffuse Large B Cell Lymphomas (DLBCL) cell SU-DHL-6 for stable expression of CARABIN. ORF of Carabin was amplified by PCR, then the lentiviral vector of over-expression Carabin was constructed using the method of Homologous recombination, confirmed by DNA sequencing and named pLENTI-cGFP-CARABIN. The constructed recombinant vector was co-transfected with psPAX2 and pMD2.G into HEK293T cells to produce the lentiviral particles on the ratio of 3∶2∶1 by PEI transfection reagent. The lentiviral particles were transduced into SU-DHL-6 cells and the infection efficiency was measured by Fluorescence Microscope. The cells were sorted by the Flow Cytometer (FCM) after 2 weeks. The expression of CARABIN and GFP in the stable cell lines was detected by Western Blot. The lentiviral vector pLENTI-cGFP-CARABIN for overexpression in blood cells was constructed and validated by sequencing. The cell line of stably overexpresiong CARABIN in SU-DHL-6 was confirmed by Western Blot. The over-expression lentiviral vector of human Carabin has been successfully constructed and cell lines for stable expression of CARABIN have been successfully established. This will shed a light on the future study of CARABIN′s function in a variety of lymphoma or leukemia models.

Key wordsCARABIN; over-expression; stable cell line; Diffuse Large B Cell Lymphomas (DLBCL)

收稿日期：2015-10-09；修回日期：2015-10-13

基金项目：国家自然科学基金(21572038)

作者简介：刘凯玉，硕士研究生，研究方向为天然产物及小分子作用机制，E-mail: 13210700141@fudan.edu.cn； 通信作者：吴家雪， 研究员，博士生导师，研究方向为DNA损伤和修复过程的分子机制研究，E-mail: jiaxue@fudan.edu.cn; 党永军，研究员，博士生导师，研究方向为天然产物和药物的分子作用机制，E-mail:yongjundang@fudan.edu.cn。

中图分类号Q782

文献标识码A

文章编号2095-1736(2016)03-0001-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.001