液相色谱串联质谱法测定卷烟主流烟气中的苯并[a]芘

张小涛，侯宏卫，陈 欢，刘 勇，王 安，胡清源

（1.国家烟草质量监督检验中心，郑州 450001；2.中国科学院合肥物质科学研究院应用技术研究所，合肥 230088）

液相色谱串联质谱法测定卷烟主流烟气中的苯并[a]芘

张小涛1,2，侯宏卫1*，陈 欢1，刘 勇2，王 安2，胡清源1,2

（1.国家烟草质量监督检验中心，郑州 450001；2.中国科学院合肥物质科学研究院应用技术研究所，合肥 230088）

为准确、快速地测定卷烟主流烟气中苯并[a]芘的含量，建立了液相色谱-大气压光电离-串联质谱测定卷烟主流烟气中苯并[a]芘的方法。方法对助剂流速、萃取溶剂、烟支数和色谱质谱测定的条件进行了优化，结果表明，当甲苯流速为80 µL/min，环己烷作为萃取溶剂，Agilent PAH（100 mm×2.1 mm，3.5 µm）作为色谱柱，95%的乙腈和5%的水为流动相，色谱柱温度为40 ℃，方法检出限为0.15 ng/mL，苯并[a]芘回收率100%～107%，相对标准偏差小于10%，分析时间为6 min，与现行的GC-MS测定卷烟主流烟气中苯并[a]芘的国家标准方法相比大大缩短了分析时间。该方法具有灵敏度高、分析时间短等优点，可以显著地提高分析的通量。

主流烟气；苯并[a]芘；大气压光电离；液相色谱串联质谱

苯并[a]芘{B[a]P}在环境中占所有多环芳烃1%～20%，可通过皮肤、呼吸道、消化道等被人体吸收，在体内的代谢活化产物能引起肝、皮肤、肺等部位的肿瘤，对生殖系统、免疫系统都具有一定毒性[1]。卷烟主流烟气中B[a]P的含量为5～40 ng/支烟[2-3]，霍夫曼名单也将其列入其中[4]，准确检测其含量对于吸烟危害性评价具有较为重要的意义。目前，卷烟主流烟气中B[a]P的测定方法主要有：液相色谱法（HPLC）[5-6]和气相色谱质谱联用方法（GC-MS或者GC-MS/MS）[7-12]。其中高效液相色谱-荧光检测法最为常见（HPLC-FL），荧光检测器具有较高的灵敏度，其检出限可以达到ng级别，但是HPLC-FL检测方法的运行时间较长，且较多的方法未应用内标，结果受前处理过程的影响比较大。GC/MS由于分离效果及色谱重现性好被广范应用于卷烟主流烟气中B[a]P分析，GB/T21130—2007[13]就是采用GC/MS测定卷烟主流烟气中的B[a]P；但是，GB/T 21130—2007方法的前处理比较复杂，且分析时间比较长（约1 h）。最近，液相色谱-大气压光电离离子源-串联质谱（LC-APPI-MS/MS）被用于复杂体系中多环芳烃的分析[14-17]。APPI使用紫外线对样品进行电离，适合于低极性化合物的电离，尤其是在引入掺杂剂后可以大幅度提高B[a]P的电离效率，进而提高灵敏度。如Ding等[14]建立了LCAPPI-MS/MS测定卷烟主流烟气中的10种致癌性的多环芳烃的方法，方法灵敏度高、专一性强，这说明LC-APPI-MS/MS适用于卷烟主流烟气中B[a]P的分离和分析，但是其需要采用两根色谱柱才能实现对10种多环芳烃的分离，Hypersil多环芳烃色谱柱（Thermo Fisher公司）分离其中的6个目标物；Xterra C18色谱柱（Waters公司）分离另外4个目标物。另外由于卷烟性质（烟丝质量、抽吸口数等）的差异，一支烟的结果不能很好的代表整个卷烟样品。

本试验针对卷烟主流烟气中的B[a]P，利用LCAPPI-MS/MS，以d12-B[a]P作为内标，建立高灵敏度、高通量的LC-APPI-MS/MS分析卷烟主流烟气中B[a]P的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

B[a]P标准品（纯度≥98%）、氘代B[a]P（d12-BaP，纯度≥98%），购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；硅胶柱（500 mg，3 mL），购自Agilent公司；乙腈和环己烷（色谱纯）购自美国TEDIA有限公司，试验中所用的水为去离子水。

安捷伦1200快速液相色谱仪（美国Agilent公司），配备有自动进样器 G1367D，二元溶剂泵G1312B，柱温箱 G1316B。API 5500三重四级杆串联质谱仪（美国AB Sciex公司），配有光电离离子源（APPI），数据采集与处理在Analyst 1.5.1软件上实现。L-2130泵（日本日立高新技术公司）和SM450直线式吸烟机（英国Cerulean公司）。

1.2 样品处理

样品平衡：样品卷烟在温度为（22±1）℃和相对湿度为（60±2）%条件下平衡48 h；卷烟样品抽吸按GB/T 19609[18]的规定收集2支卷烟的总粒相物。

将剑桥滤片放入25 mL三角瓶中，加入20 μL的1 µg/mL的苯并[a]芘氘代内标，再加入10 mL环己烷，振荡萃取60 min。萃取液经硅胶柱固相萃取，然后用6 mL环己烷洗脱，收集滤液和洗脱液，旋转蒸发仪蒸干后，复溶于1 mL的乙腈，待测。

1.3 标准工作溶液的配制

分别准确称取10 mg的B[a]P和d12-B[a]P固体于两个10 mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度，分别得到1 mg/mL的B[a]P和d12-B[a]P储备液。然后用储备液稀释配制不同浓度的B[a]P标准溶液和工作溶液。

1.4 色谱质谱条件

色谱条件：Agilent PAH色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 µm）；流动相：水，乙腈；色谱柱温度为40 ℃；进样量2 µL。掺杂剂：甲苯，流速为80 μL/min；洗脱条件：乙腈：水，95：5（V/V），流速为300 μL/min，分析时间为6 min。

质谱条件：光电离离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：700 V；雾化气：75 psi；气帘气：15 psi；辅助加热气：50 psi；温度：600 ℃；射入电压：10 V；碰撞能：9 eV；去簇电压：110 V；驻留时间：50 ms。内标离子对，265.2～263.1，B[a]P定性离子对，253.2～251.1，定量离子对：253.2～252.1。整个分析过程由Applied Biosystems Analyst 1.5.1 软件来控制。

1.5 统计分析方法

配对样品t检验采用IBM SPSS Statistic 20.0软件进行。

2 结 果

2.1 助剂流速的优化

在APPI源使用过程中，往往需要使用助剂来提高离子化效率，助剂作为光电离的媒介，主要通过交换电荷或质子转移帮助待测物形成离子[19-20]。先前研究表明助剂的流速对分析灵敏度有很大的影响[21]，因此考察了甲苯的流速（40，60，80和100 µL/min）对B[a]P测定结果的影响，结果如图1所示。从图1可以看出，甲苯的流速对B[a]P测定结果有显著影响，当甲苯流速为80 µL/min时，B[a]P的响应最高，因此最终选择了80 µL/min作为甲苯的流速。

图1 甲苯流速对离子化效率的影响Fig. 1 The influence of flow rate of toluene on ionization efficiency

2.2 流动相的选择

Syage等[22]研究结果表明，流动相对于B[a]P的离子化效率存在一定影响，因此本试验对甲醇和水（V甲醇:V水=95:5）、乙腈和水（V乙腈:V水=95:5）作为流动相时B[a]P的色谱质谱条件进行了优化。正如文献报道的，对于质谱而言，使用甲醇作为流动相可以增加B[a]P的离子化效率，但是当样品中B[a]P的含量增高时，色谱峰形展宽，分析时间明显延长（图2a）。考虑到主流烟气样品比较复杂，为了改善峰形和缩短分析时间、减少有机溶剂消耗，本试验最终选择乙腈和水作为流动相，这与文献报道是一致的[13]，典型的色谱图如图2b所示。

2.3 萃取溶剂的选择

图2 不同流动相B[a]P的提取离子图（a，V甲醇:V水=95:5；b，V乙腈:V水=95:5）Fig. 2 The extract ion chromatogram of B[a]P （a Methanol and water were used as mobile phase. b Acetonitrile and water were used as mobile phase）

目前文献报道的用于萃取卷烟主流烟气中 B[a]P的溶剂有甲醇[5]、乙腈[14]、二氯甲烷[16]、环己烷[6]等。考虑到所使用的流动相为乙腈和水，因此本试验对乙腈和环己烷两种有机溶剂进行了比较。以3R4F卷烟作为试验卷烟，按照GB/T 19609的方法捕集2支烟的总粒相物，分别用乙腈和环己烷萃取、净化和检测，其结果如图3所示，可见环己烷的萃取效率明显高于乙腈。此外，由于乙腈的极性比较强，在萃取出B[a]P的同时也会把一些极性物质萃取出来，因此会干扰后面的色谱分离；而环己烷提取B[a]P的效率比较高[2]，且干扰比较少。因此本试验选择了环己烷作为萃取溶剂。

图3 不同萃取溶剂对B[a]P的萃取效率Fig. 3 The extraction effect of different solvents on B[a]P

2.4 烟支数的选择

采用剑桥滤片分别收集了2支和5支参比卷烟（中国烟草总公司自制）的总粒相物，分别进行5次平行试验，并对测试的结果进行了比较分析，其平均值分别为7.24和7.37 ng/支，相对标准偏差分别为9.39%和7.19%，这说明2支烟和5支烟粒相物分析的结果差异很小，为了减少样品制备的时间和减少有机溶剂的消耗，最终选择了2支烟。

2.5 线性方程和检出限

吸取2，5，10，20，40和60 ng/mL的标准溶液和振荡萃取液固相萃取后的样品各2 µL，注入LC-APPI-MS/MS系统进行分离分析。B[a]P的线性回归方程为y=0.187x+0.0105，线性良好，相关系数为0.9993。利用信噪比的方法计算方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，三倍信噪比对应的浓度为检出限。B[a]P的定量限和检出限分别为0.50 ng/mL和0.15 ng/mL，B[a]P的保留时间为3.02 min。

2.6 方法的回收率和重复性

采取样本加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了3个添加水平，每个添加水平重复测定5次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表1。B[a]P的回收率在100%～107%，RSD小于10%，证明方法的准确性和重复性结果较好。

表 1 B[a]P的回收率和重复性Table 1 The recovery and repeatability of B[a]P

2.7 方法应用

利用建立的LC-APPI-MS/MS方法测定了12个国产卷烟样品主流烟气中B[a]P的释放量，结果见表2。另外，对本方法测试结果和国标测试方法的结果进行了配对样品t检验，sig值大于0.05，说明两种方法测定结果相差不大，符合定量分析要求。

表2 GB/T 21130—2007规定的GC/MS与本方法的比较Table 2 Method comparison with the GC-MS method of GB/T 21130-2007

3 讨 论

B[a]P是存在于卷烟主流烟气中的对人体具有致癌或致畸作用的污染物质，因此快速测定烟气中的B[a]P对卷烟质量监控和健康风险评估具有十分重要的意义。本研究针对卷烟主流烟气粒相物中B[a]P，优化了甲苯流速、烟支使用数目，建立了LCAPPI-MS/MS测定主流烟气中B[a]P的高灵敏和高选择性的方法。

卷烟烟气总粒相物中B[a]P的测定方法[13]采用的是转盘吸烟机，共捕集20支烟的总粒相物，Ding等[14]报道的方法中采用一支烟的粒相物来测定10种多环芳烃，但由于卷烟自身性质的差异，1支烟的结果不能很好的代表卷烟样品。本研究采用2支烟可以减少有机溶剂的使用量和提高分析通量。标准GB/T 21130—2007规定的GC/MS测定卷烟主流烟气中B[a]P的方法分析一个样本需要大概50 min，而本研究建立的LC-APPI-MS/MS方法分析1个样本只需要6 min，大大提高了分析的通量。

本方法具有高的检测灵敏度，方法检测限为0.15 ng/mL，GB/T 21130—2007规定的GC/MS方法的检测限为1.44 ng/mL[13]，与GC-MS方法相比其检测灵敏度提高了约10倍。此外利用建立的LCAPPI-MS/MS方法和GB/T 21130—2007规定的GC/MS法分别测定了12个国产卷烟样品主流烟气B[a]P并进行了配对样品t检验，sig值大于0.05，说明两种方法的测定结果相差不大，LC-APPIMS/MS方法可以满足烟气中B[a]P的检测要求。

建立的LC-APPI-MS/MS测定卷烟主流烟气中B[a]P的方法具有较好的选择性与较高的准确性，大气压光电离离子源的应用提高了B[a]P的离子化效率，从而提高方法的灵敏度，可用于卷烟主流烟气中B[a]P的快速测定。

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Determination of Benzo[a]pyrene in Mainstream Cigarette Smoke by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiaotao1,2, HOU Hongwei1*, CHEN Huan1, LIU Yong2, WANG An2, HU Qingyuan1,2

(1. China National Tobacco Quality Supervision & Test Centre, Zhengzhou 450001, China; 2. Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, CAS, Hefei 230088, China)

In order to accurately and rapidly determine B[a]P content in mainstream cigarette smoke, a liquid chromatographyatmospheric pressure photoionization-tandem mass spectrometry (LC-APPI-MS/MS) for determination B[a]P in mainstream cigarette smoke was developed and validated. The flow rate of toluene, extraction solvent, number of cigarette and the conditions of liquid chromatography and mass spectrometry were optimized. The results indicated that when the flow rate of toluene was 80 µL/min, cyclohexane was used as extraction solvent, chromatographic separation was achieved by using an Agilent PAH column (100 mm×2.1 mm, 3.5 μm) at 40 ℃, and 95% acetonitrile and 5% water was selected as the mobile phase, the detection limit of the method was 0.15 ng/mL, the recovery of B[a]P was 100%-107%, the relative standard deviation was less than 10%, and the analysis time was 6 min. Compared with the existing GC-MS method for the determination of B[a]P in mainstream cigarette smoke, this method shortened the analysis time. The proposed method has the advantages of high sensitivity and short analysis time etc., which can significantly improve the throughput.

mainstream cigarette smoke; benzo[a]pyrene; APPI; LC-MS/MS

TS41+1

1007-5119（2016）06-0077-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.014

国家自然科学基金项目“基于代谢组学的头颈癌生物标志物的发现及其与烟气苯并芘的关系研究”（21277174）

张小涛（1988-），男，博士研究生，主要从事吸烟与健康、生物标志物研究工作。E-mail：zhangxiaotao9209@163.com *通信作者，E-mail：qsfctc@163.com

2016-04-11

2016-07-31