基于微管蛋白基因的烟草根黑腐病菌分子检测

曹继芬，户艳霞，王新中，徐发华，杨明英，赵志坚*

（1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205；2.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000）

基于微管蛋白基因的烟草根黑腐病菌分子检测

曹继芬1，户艳霞2，王新中2，徐发华2，杨明英1，赵志坚1*

（1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205；2.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000）

建立一种烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测方法。以β-微管蛋白基因为靶标设计了特异性引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR用于根黑腐病菌的PCR检测，对其检测特异性、灵敏度、早期诊断技术进行了测试。结果显示，只有根黑腐病菌能扩增到一条254 bp的特异性条带，其他19种真菌、卵菌及阴性对照均无扩增产物，表明该对引物能特异性地检测根黑腐病菌。该引物对根黑腐病菌基因组DNA检测的灵敏度为10 fg/μL。Tbas-tub2F/Tbas-tubR可从接种侵染24 h后的烟草组织中检测到根黑腐病菌，从而对根黑腐病进行准确的早期诊断。开发了烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测和早期诊断技术。

烟草；根黑腐病菌；β-微管蛋白基因；分子检测

烟草根黑腐病是由根串珠霉[Thielaviopsis basicola (Berk. et Br.)]在烟草上引起的一种重要真菌性土传病害[1]，它遍布世界主要产烟区，使烟草生产遭受重大损失。该病原菌可侵染为害多种植物，如烟草、棉花、豆类、花生、柑桔及多种观赏的植物[2-7]。烟草根黑腐病近年来在我国有加重为害的趋势，云南、贵州、湖北等省发生较重，山东、河南、安徽、吉林、福建等省也有发生[8]。烟草根黑腐病与烟草疫霉引起的黑胫病早期侵染症状相似，而且常与其他烟草根茎部病害混合发生，给病害的识别与诊断造成困难，影响病害的正确防控。传统的植物病害检测方法因检测周期长、操作复杂、灵敏度低，且经验性强，难以快速、准确地鉴定，很容易错过病害防治的最佳时期。建立快速、简便准确的检测方法，可对病害的早期诊断和及时防控提供科学依据。

随着分子生物学技术的快速发展，以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，其具有的特异性、灵敏性和快速性等特点成为植物病原菌分类和鉴定应用最广泛的技术之一，有效地弥补了传统分类鉴定方法的不足[9-13]。尤其是基于实时荧光定量PCR（real time-PCR）和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）可视化快速检测新技术已在一些植物病原菌的检测中得到成功应用，是今后植物病害快速检测的新方向[14-15]。最近，基于实时荧光定量PCR检测烟草根黑腐病菌的技术已成功建立，检测的灵敏度比传统的PCR提高了10～100倍[14]。目前已报道的烟草根黑腐病菌分子检测技术均是针对病原菌核糖体内转录间隔区（ITS）设计的特异扩增引物[8,14]，检测的靶标非常单一，通常难以区分亲缘关系较近的近缘种，因此有必要开发新的靶标作为已有检测方法的补充。β-微管蛋白基因包含有多个外显子和内含子，内含子在不同物种之间有较大的变异，适合于设计引物进行分子检测以区分不同的物种[16]。烟草根黑腐病菌的β-微管蛋白基因能否作为新的分子检测靶标，本研究对该靶标进行了特异性PCR检测引物筛选，并对其检测特异性、灵敏度、早期诊断技术进行了分析，以期为烟草根黑腐病的快速检测和早期诊断提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

不同种类的真菌和卵菌供试菌株共23个（表1）。其中根串珠霉参考菌株YYD和YYZ由西南大学窦彦霞博士惠赠[17]，其余菌株均由云南省农业科学院农业环境资源研究所作物疫病实验室保存。

1.2 病原菌基因组及植物组织DNA的制备

供试菌株分别在V8液体培养基中培养1周后，用灭菌滤纸压干水分收获菌丝体。供试菌株菌丝体DNA与健康烟草胫部和根部组织DNA均采用改良的CTAB法进行提取。获得的基因组DNA加入含有10 μg/mL RNase A的灭菌超纯水进行溶解，置于-20 ℃备用。

1.3 特异性扩增引物的设计及PCR检测

从GenBank下载根黑腐病菌和其他物种的β- 微管蛋白基因DNA序列，基于目前已报道的根黑腐病菌β-微管蛋白基因，与其他物种进行多序列比对、分析。基于根黑腐病菌与其他物种碱基差异较大的区域，利用Primers3软件进行引物设计。分别设计了两对用于烟草根黑腐病菌特异性分子检测的引物，即Tbas-tub1F/Tbas-tubR（序列为：上游引物Tbas-tub1F：5′-ACGTACCGCCCTATCAATCC -3′，下游引物Tbas-tubR：5′-ATGCGCTTGAACAG CTCCTG -3′），预期扩增片段大小为260 bp，Tbastub2F/Tbas-tubR（序列为：上游引物Tbas-tub2F：5′-CGCCCTATCAATCCACTTATCC -3′，下游引物Tbas-tubR：5′-ATGCGCTTGAACAGCTCCTG-3′），预期扩增片段大小为254 bp。引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。PCR反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa）仪器上完成。50 μL PCR反应体系包括5 μL 10× reaction Buffer，5 μL 100 mmol/L MgCl2buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，10 µmol/L引物各1 μL，0.5 μL rTaq Polymerase (2.5 U/μL)，加入1μL模板DNA后用灭菌超纯水补足体积。热循环反应参数为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 μL PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，在Bio-Rad ChemiDoc MP（Bio-Rad）凝胶成像系统下拍照。

1.4 引物Tbas-tub2F /Tbas-tubR对烟草根黑腐病菌的灵敏性检测

提取的烟草根黑腐病菌基因组DNA经Thermo Nanodrop 2000分光光度计（Thermo）测定浓度后，采用10倍系列稀释基因组DNA浓度为100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg备用。利用Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物对烟草根黑腐病菌10倍系列稀释基因组DNA进行PCR扩增。20 μL PCR反应体系包括2 μL 10× reaction Buffer，1.2μL Mixture，10 µmol/L引物各0.4 μL，0.1 μL rTaq100 mmol/L MgCl2buffer，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPPolymerase (5 U/μL)，加入1 μL模板DNA后 用灭菌超纯水补足体积。热循环反应参数为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR结束后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

表1 烟草根黑腐病菌特异性分子检测供试菌株Table 1 The plant pathogens used in specific molecular detection

1.5 烟草根黑腐病菌的早期快速诊断

1.5.1 烟草根黑腐病病样组织的准备 用手术刀切取PDA培养1周的烟草根黑腐病菌菌丝块1 cm×1 cm接种在生长6周的健康烟草品种红花大金元根茎结合处，22～23 ℃RXZ智能型人工气候箱（宁波江南仪器厂）中保湿培养。分别取接种后6、12、24、48、72 h和5 d的烟草根茎部作为病样组织用于DNA的提取，3次重复。

1.5.2 烟草带病组织DNA快速提取及PCR检测 烟草根黑腐病菌侵染的病组织按照NaOH快速裂解法提取DNA[18]。具体过程如下：将未接种的健康烟苗根茎部和侵染6、12、24、48、72 h和5 d的烟草带病组织（病茎、病根）用自来水清洗干净、吸水纸吸干水分，用手术刀切取含接种点上下各1.5 cm组织并称量；按1 mg病组织加入10 μL裂解液（0.5 mol/L NaOH + 0.5% PVP）计量，根据病组织的质量，加入适量的裂解液，在灭菌研钵中充分将病组织研磨后转移至1.5 mL的离心管中，12 000 rpm离心5 min；取100 μL上清液与等体积的0.1 mol/L Tris（pH 8.0），混匀；取1 μL混合液作为模板直接用于PCR扩增反应。使用与1.4相同的PCR反应体系和热循环反应参数，每个病样组织DNA样品3次重复。PCR结束后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 结 果

2.1 烟草根黑腐病菌特异性引物的设计及PCR检测

基于烟草根黑腐病菌β-微管蛋白基因设计的特异性分子检测的引物Tbas-tub1F/Tbas-tubR从YYZ和YYD两个烟草根黑腐病菌参考菌株中均能扩增出唯一的、符合预期大小的目的片段，但是从其他供试的3个非烟草根黑腐病菌的对照菌株中也扩增出大小不一的片段（图1），表明该引物对可以用于已知根黑腐病菌的检测，但是特异性不高，不适于烟草根黑腐病的诊断。另一引物对Tbas-tub2F/TbastubR的PCR扩增结果显示（图2），所有供试的DNA样品中只有4个烟草根黑腐病菌能扩增出唯一的、符合预期大小的目的片段，而其他用作对照的不同疫霉、腐霉和真菌及阴性对照均没有扩增产物，表明设计的引物对Tbas-tub2F/Tbas-tubR能够特异性地检测烟草根黑腐病菌，可以用于烟草根黑腐病的诊断分析。

图1 Tbas-tub1F/Tbas-tubR对烟草根黑腐病菌的 PCR特异性扩增Fig. 1 Specific-PCR amplification of primers Tbastub1F/Tbas-tubR to Thielaviopsis basicola

图2 Tbas-tub2F /Tbas-tubR对烟草根黑腐病菌的 PCR特异性扩增Fig. 2 Specific-PCR amplification of primers Tbastub2F/Tbas-tubR to Thielaviopsis basicola

2.2 引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR对烟草根黑腐病菌的灵敏性检测

以10倍系列稀释的烟草根黑腐病菌基因组DNA为模板，特异性引物对Tbas-tub2F/Tbas-tubR从100 ng至10 fg均可扩增出一条大小为254 bp的特异性条带，其中100 fg和10 fg扩增的条带相对较弱，当模板DNA浓度低至1 fg时，未能扩增出相应的条带，表明Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物对烟草根黑腐病菌的检测灵敏度下限可达10 fg，如图3。该结果比已报道的以ITS为靶标设计烟草黑胫病菌特异性检测的引物灵敏度检测极限100 fg高10倍，更高于刘萍花等[19]报道的10 pg/μL，表明以β-微管蛋白基因为靶标设计的引物对烟草根黑腐病菌有较高的检测灵敏度，优于以ITS为靶标设计的引物。

2.3 烟草根黑腐病菌的早期快速诊断

按照NaOH快速裂解法提取烟草组织DNA， 用作阴性对照的健康烟草组织、烟草根黑腐病菌侵染6、12 h的病样组织均没有扩增产物；而从烟草根黑腐病菌侵染24、48、72 h和5 d的病样组织与用作阳性对照的根黑腐病菌DNA可以扩增出一条清晰的大小为254 bp的条带（图4），说明烟草组织中检测出了根黑腐病菌，发病组织感染了烟草根黑腐病菌。结果还进一步表明，通过烟草带病组织DNA快速提取方法，Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物在根黑腐病菌侵染的初期阶段即6 h和12 h时，不能从烟草组织中检测到病原菌，可能是因为侵染初期阶段侵入烟草组织内部的菌量较少、用NaOH法快速提取的病原菌DNA浓度过低而检测不到，但在根黑腐病菌侵染烟草24 h以后，即植株尚未显病症的早期阶段，Tbas-tub2F/Tbas-tubR引物可从烟草组织中检测到病原菌，从而对根黑腐病进行准确的诊断和鉴定。

图3 Tbas-tub2F/Tbas-tubR对烟草根黑腐病菌 的灵敏度检测Fig. 3 Sensitivity detection of Tbas-tub2F/Tbas-tubR to genomic DNA of T. basicola

图4 不同侵染阶段烟草组织中根黑腐病菌的快速诊断Fig. 4 Rapid diagnosis of T. basicola in tobacco tissues at different infection stages

3 讨 论

PCR技术的建立极大地提高了植物病原菌分类鉴定和病害诊断的效率，成为植物病害研究中应用最广泛的技术之一，有效地弥补了传统分类鉴定方法的不足[9-13]。根黑腐病是烟草生产中重要的土传病害，常与其他烟草腐生性病害混合侵染，给病害的正确诊断造成困难。目前已有研究者报道了对烟草根黑腐病菌的分子检测技术，如赵永强等[8]根据烟草病原真菌核糖体基因转录间隔区ITS序列间的差异，设计了特异性引物TB-5/TB-3，对T.basicola进行了分子检测，其灵敏度可达100 fg/μL。康振辉等[14]根据ITS区设计特异性引物Tb1/Tb2，建立了实时荧光定量PCR的方法检测土壤中的烟草根黑腐病菌，结果表明，该体系的检测下限为100 fg/μL基因组DNA。刘萍花等[19]也使用赵永强等[8]报道的特异性引物，建立了多重PCR检测烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌的技术体系，该体系检测的灵敏度下限为10 pg/μL，低于前人报道的100 fg/μL。以上的根黑腐病菌检测技术均是基于靶标ITS区设计引物进行的检测，一旦有亲缘关系较近的近缘种，仅靠单个靶标ITS区间DNA序列的差异可能难以区分不同的近缘种，因此有必要开发新的靶标来互补已有的检测方法。以上这些研究仅针对根黑腐病菌进行了特异性检测，没有对病害的早期诊断进行测试，因此不能确定报道的特异性引物是否能用于病害的早期诊断。

生物的微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白组成，对于保持细胞形状、运动、胞内物质运输有不可或缺的作用，是维持生物基本功能的持家基因。B-微管蛋白基因包含有多个外显子和内含子，内含子在不同物种之间有较大的变异，适合于作为靶标设计引物进行分子检测区分不同的物种。本研究基于烟草根黑腐病菌β-tubulin基因序列与其他物种进行多重比对分析后，根据特异基因片段开发了新的烟草根黑腐病菌PCR检测引物Tbastub2F/Tbas-tubR，对其检测特异性、灵敏度进行了研究，结果表明该引物特异性强，只能从烟草根黑腐病菌的基因组DNA中扩增出254 bp的片段，不能从其他供试的19种真菌和卵菌的基因组DNA中扩增出任何片段。相对于已报道的ITS靶标开发的引物仅对少量不同病原菌进行的测试，本研究可以充分保证检测结果的特异性。通过对烟草根黑腐病菌DNA系列浓度梯度为模板的扩增结果显示，本研究开发的引物对烟草根黑腐病菌的检测灵敏度下限为10 fg/μL，能够对微量的烟草根黑腐病菌进行检测，该结果与ITS为靶标设计的引物灵敏度有所差异，检测极限优于ITS为靶标的100 fg/μL，而且也优于实时荧光定量PCR的检测极限100 fg/μL[8,14]，说明以β-tubulin基因为靶标开发的引物检测灵敏度更高，可以检测出更微量的病原菌。对病原菌侵染烟草不同时段的组织进行检测发现，本研究以β-tubulin基因为靶标开发的特异性引物在根黑腐病菌侵染的初期阶段即6 h和12 h时，该引物不能从烟草组织中检测到病原菌，可能与侵染初期阶段侵入烟草组织内部的菌量较少、采用NaOH快速裂解法提取烟草带病组织DNA的浓度过低有关。但在根黑腐病菌侵染烟草24 h、肉眼尚不能观察到病症的早期阶段，即可从烟草组织中检测到病原菌，从而对根黑腐病进行准确的诊断和鉴定，表明Tbastub2F/Tbas-tubR引物可用于烟草根黑腐病的早期诊断，我们将在进一步的研究中用实时荧光定量PCR对早期侵染进行诊断。此外，从烟草黑腐病病样组织清洗、病原菌或病样组织DNA快速提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳到获得检测结果，整个过程可在3.5 h以内完成，与常规的生物检测方法相比，操作简单便捷，大大缩短了鉴定所需的时间，可及时对生产提供防控参考。

4 结 论

本研究开发了烟草根黑腐病菌新的分子检测靶标，设计的特异性PCR扩增引物Tbas-tub2F/TbastubR有较高的检测灵敏度，可用于烟草根黑腐病菌的快速鉴定及病害的早期诊断。

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《烟草科技》2016年第12期目次

硅对镉胁迫下烟草光合作用的影响……………………….………………………………………郑明瑜，罗丽娟，李荟星，等 1

授粉时期和套袋方式对烟草母本起源单倍体鉴定效率的影响…………………………………曾建敏，焦芳婵，童治军，等 8

洛阳地区烟草根际土壤中多粘类芽孢杆菌的分离与鉴定………………………………………宋喜乐，赵世民，赵云波，等 13

烤烟中部烟叶外观区域特征分布及其与外观品质和物理特性的关系…………………………过伟民，蔡宪杰，王信民，等 21

烟梗（末）有机肥对烟田土壤养分、病害发生及烟叶产质量的影响……………………………耿明明，赵 建，贾瑞莲，等 28

烟草生物碱：口腔特性及在电子烟烟气中的感官响应………………….………………………刘俊辉，杨伟平，张启东，等 35

国内口用型无烟气烟草制品专利分析……………………….……………………………………刘亚丽，郑新章，洪群业，等 40

卷烟纸裂解致孔对主流烟气中HCN释放量的影响……………………….……………… ……刘 源，银董红，尹升福，等 46

HPLC-MS/MS法测定烟用纸张中的高氯酸根……………………….……………………………王 颖，杨 飞，边照阳，等 54

微波膨胀梗丝加工工艺的选择及优化……………………….……………………………………赵云川，邹 泉，廖晓祥，等 60

基于分布活化能模型的烟草燃烧动力学特性研究……………………….………………………王 昭，戴 亚，马扩彦，等 71

基于线光源传感器的滤棒长度在线测量系统……………………….…………………………………王 盛，陆海华，郑林杰 79

梗丝超级回潮机含水率控制系统的改进……………………….…………………………………… ……………………丘柳明 86

基于热力图的卷烟市场数据可视分析系统……………………….………………………… ………邓 超，宋金伟，孙瑞志等 91

Molecular Detection of Tobacco Black Root Rot Pathogen Based on β-tubulin Gene

CAO Jifen1, HU Yanxia2, WANG Xinzhong2, XU Fahua2, YANG Mingying1, ZHAO Zhijian1*

(1. Agricultural Environment & Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China; 2. Dali Branch of Yunnan Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

To establish a molecular detection method of new target for tobacco black root rot caused by Thielaviopsis basicola, βtubulin gene was selected as a new target and a pair of species-specific primers Tbas-tub2F /Tbas-tubR was designed to detect T. basicola by PCR. The specificity, sensitivity and early diagnosis technology of the primers were assayed. The results showed that an expected 254 bp band could be amplified only from T. basicola and no PCR product was amplified from any of the other nineteen fungi and oomycetes and negative control, which suggested that the primers could be used to detect T. basicola specifically. The detection sensitivity of Tbas-tub2F/Tbas-tubR primers was 10 fg genomic DNA of T. basicola. The pathogen could be detected from tobacco tissues 24 hours post inoculation thus the primers were good for early accurate diagnosis of tobacco black root rot disease. In this study we developed an alternative new target for both molecular detection and early diagnosis of tobacco black root rot caused by T. basicola.

tobacco; Thielaviopsis basicola; β-tubulin gene; molecular detection

S435.72

1007-5119（2016）06-0060-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.011

中国烟草总公司云南省公司科技项目“大理州红花大金元两黑病持续控制技术研究及应用”（2013YN27）

曹继芬（1971-），女，副研究员，主要从事植物真菌、卵菌病害研究。E-mail：cjf016@sina.com。*通信作者，E-mail：zhijianzhao@hotmail.com

2016-03-10

2016-10-10