不同浓度肺炎链球菌造成大鼠脑膜炎模型的实验研究

董　燕　杜开先(通讯作者)　贾天明　张晓莉　张　燕　宋丽丽

1)郑州大学第三附属医院神经内科　郑州　450052　　2)河南省红十字血液中心　郑州　450000

不同浓度肺炎链球菌造成大鼠脑膜炎模型的实验研究

董燕1)杜开先1)(通讯作者)贾天明1)张晓莉1)张燕2)宋丽丽1)

1)郑州大学第三附属医院神经内科郑州4500522)河南省红十字血液中心郑州450000

【摘要】目的通过不同浓度肺炎链球菌造成大鼠细菌性脑膜炎模型，选出最合适的造模菌株。方法3周龄SD大鼠40只随机分为生理盐水对照组(10只)、细菌性脑膜炎模型组(模型组分3组，每亚组各10只)。应用不同浓度(106、107、108 cfu/mL)肺炎链球菌Ⅲ型对大鼠脑池穿刺建立细菌性脑膜炎模型，应用等体积生理盐水替代肺炎链球菌作对照组，观察终点为动物自然死亡或造模5 d。比较各组大鼠病死率、生理指标变化、Loeffler神经行为学评分、脑组织形态学改变表达。结果高浓度组较低浓度组病死率高，体质量增长慢，体温升高快；Loeffler神经行为学评分低，脑组织水肿明显(P均<0.05)。结论脑池内直接注射细菌后，能诱导出细菌性脑膜炎。通过控制菌株浓度，可造成不同程度的脑膜炎模型。107 cfu/mL为最佳造模浓度。

【关键词】大鼠；肺炎链球菌；脑膜炎；模型；实验研究

细菌性脑膜炎是儿科中常见的危急重病，病死率和致残率极高[1-2]。近年来国内外采用多种方式造成动物细菌性脑膜炎模型[3-5]，以此研究脑膜炎的发病机制及治疗。而对不同浓度菌株造成模型的轻重程度的评估，目前国内外尚不统一。肺炎链球菌脑膜炎是我国最常见的细菌性脑膜炎之一，婴儿期较多。本实验旨在建立不同浓度菌株造成细菌脑膜炎的模型，为找出造模的最佳条件奠定基础，有利于细菌性脑膜炎的防治研究。

1材料和方法

1.1细菌悬液的制备菌株购自中国药品食品检定研究院中国医学细菌保藏管理中心(菌号31003)，接种于血琼脂糖培养基，在37 ℃ 5%二氧化碳环境中生长过夜，再接种于VITAL AER肉汤里，生长至对数生长中期收菌，离心，用生理盐水冲洗，再离心，用盐水稀释105～108cfu/mL。

1.2脑膜炎的诱导取自郑州大学医学实验动物中心3周龄SD大鼠50只，雌雄不限。随机分为盐水对照组(S组，n=10)、实验组(E1、E2、E3，n=10)。用10%水合氯醛液2 mL/kg腹腔注射麻醉后，固定于立体定向仪，脑膜炎的诱导改进于刘心洁、Diab等[4-7]的方法，小脑延髓池穿剌，移去50 μL脑脊液并培养，试验组注入50 μL 106～108cfu/mL肺炎链球菌悬液，对照组注射50 μL生理盐水，置笼中喂养，每日记录大鼠体温、体质量，观察临床表现。观察终点为动物自然死亡或造模5 d，深麻醉后再从脑池取脑脊液50 μL做培养，断头处死大鼠。

1.3大鼠Loeffler的神经行为学评分按5分制评分方法进行评估。5分：抓住背部时能正常运动，5 s内翻身；4分：自主运动减少，5 s内能翻身；3分：>5 s翻身；2分：不能翻身；1分：不能运动。

1.4HE染色切片观察断头后肉眼观察脑组织，取左侧大脑4%多聚甲醛固定过夜，脱水、冠状切片石蜡包埋，切成5 μm厚切片，做HE染色切片。显微镜下观察组织细胞学形态。

2结果

2.1临床表现及病死率E1组大鼠仅表现精神稍差、进食少，无死亡大鼠；E2组大鼠出现精神差、拒食、嗜睡、反应迟钝，4例死亡(2例造模第2天死亡，1例造模第3天死亡，1例第4天死亡)，病死率40%；E3组运动失调，原地打转，四肢发绀，最终昏迷伴全身抽搐、死亡，造模1 d内全部死亡，病死率100%。E2、E3组病死率较S组差异均有统计学意义(P<0.05)，E3组病死率较E2组差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2脑脊液培养E组感染前脑脊液无细菌生长，感染后24 h脑脊液培养出与接种同株的肺炎链球菌。S组注射前后均无细菌生长。

2.3体温、体质量的改变见表1、2。初始各组体温比较差异无统计学意义(P>0.05)，E1、E2组体温均趋于上升趋势(P<0.05)，造模24 h、48 h、5 d体温E2组较E1组差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1　各组大鼠体温比较，℃)

注：与S组同时间点比较，#P<0.05；与E1组同时间点比较，*P<0.05；与同组初始时间点比较，@P<0.05；与同组24 h比较，%P<0.05

表2　各组大鼠体质量比较±s，g)

注：与S组同时间点比较，#P<0.05；与E1组同时间点比较，*P<0.05

各组初始体质量差异均无统计学意义(P>0.05)，48 h、5 d体质量E1组较同时间点S组差异均有统计学意义(P<0.05)，24 h、48 h、5 d体质量E2组较同时间点S组差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4Loeffler神经行为学评分见表3。同时间点比较E1、E2组较S组差异均有统计学意义(P<0.05)。E2与E1相同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表3　各组大鼠Loeffler神经行为学评分比较

注：与S组同时间点比较，#P<0.05；与E1组同时间点比较，*P<0.05

2.5脑组织肉眼观察及病理形态学观察造模5 d处死大鼠取脑组织肉眼观察，S组无异常，E组水肿明显，有炎症粘连和灶性出血。HE染色切片观察：S组无病理性损伤，造模组大鼠脑组织形态发生明显改变，E1组神经元细胞出现固缩，细胞及血管周围出现腔隙；E2组神经元细胞固缩明显，血管周围腔隙明显增宽，可见炎性细胞浸润(图1)。

对照组

E1组5 d

E2组5 d

3讨论

细菌性脑膜炎是儿童常见的疾病之一，部分可遗留严重的神经系统后遗症，肺炎链球菌性是婴儿颅内感染病原菌中最多见的细菌[6-8]。系统研究肺炎链球菌型脑膜炎，在该病的诊断治疗、减少甚至避免并发症的出现等领域起至关重要的作用。

目前，国内外脑膜炎的动物模型的建立可通过不同的方法，樊一斌等[9]通过尾静脉接种隐球菌构建小鼠中枢神经系感染模型，与本研究造模方式不同；Huang等[10]通过幼鼠延髓小脑池注入B族溶血性链球菌构建大鼠脑膜炎模型，与本研究脑膜炎类型不同；Cao等[11]通过对3%氯化钠溶液对脂多糖造成的脑水肿模型中作用的研究与脑水肿相关的AQP4的表达，与本研究造模方式及研究目的不同，且目前对不同程度脑膜炎大鼠临床表现的研究甚少。本文旨在通过对大鼠小脑延髓池注射菌株造成脑膜炎模型，通过病死率、脑脊液培养、病理形态学观察等证实模型制造成功。同时发现，菌株浓度不同，大鼠临床表现各异，Loeffler的神经行为学评分107较106组低。各组时间点体温、体质量变化差异有统计学意义。为此，可通过控制菌株的浓度造成不同程度脑膜炎模型。

总之，通过对不同浓度菌株造成脑膜炎模型，通过大鼠临床表现、神经行为学评分、体质量改变、病死率、脑组织病理学改变，最终表明107cfu/mL为最佳造模浓度，造模后及时治疗是控制病死率的关键。通过本实验可评估造模成功与否并了解造模轻重程度，利于探讨脑水肿的发生机制，为细菌性脑膜炎的诊治奠定基础。

4参考文献

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[10]Huang J，Lu WT，Sun SQ，et al.Upregulation and lysosomal degradation of AQP4 in rat brains with bacterial meningitis[J].Neurosci Lett，2014，30(566)：156-161.

[11]Cao C，Yu X，Liao Z，et al.Hypertonic saline reduces lipopolysaccharide-induced mouse brain edema through inhibiting aquaporin 4 expression[J].Crit Care，2012，16(5)：R186.

(收稿 2015-06-21)

Study of bacterial meningitis models in rats induced by different concentration of bacteria

DongYan*，DuKaixian，JiaTianming，ZhangXiaoli，ZhangYan，SongLili

*DepartmentofPediatric，theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，ChinaCorrespondingauthor：DuKaixian

【Abstract】Objective To choose the most approprite bacterial concentration to induce bacterial meningitis model.Methods Sprague-Dawley rats on postnatal 3 weeks were divided into 4 groups randomly.The model groups were established by direct intracisternal injecting different concentration of streptococcus pneumoniae Ⅲ(SPⅢ)(106，107，108 cfu/mL)into cerebellomedullary cistern，the saline(NS)control group was injected by NS.The end was the death of the rats or days after model established.The rats were observed death rate，the physiological index，Loeffler’s neuroethology score，etc.Results The death rate of high concentration group was higher than that of the low concentration group，while the weight growth was slower，the body temperature increased faster，Loeffler neurobehavioral score was lower and brain tissue was more obviously edema(P<0.05).Conclusion Bacterial meningitis model could be induced by direct intracisternal injection of a suspension of SPⅢ on postnatal 3 weeks in SD rats.To control the concentration of the bacteria could control the degree of the bacterial meningitis model.107 cfu/mL was the most comfortable concertration to induce the model.

【Key words】SD rat；Streptococcus pneumoniaeⅢ；Bacterial meningitis；Model；Study

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)11-0023-02