慢性期慢性粒细胞白血病患者BCR-ABL与PTEN关系的临床观察

焦卫云，李　坦，李　斌，刘媛媛，胡雪莹，鲍扬漪

(合肥市第一人民医院血液科，安徽 合肥　230023)

慢性期慢性粒细胞白血病患者BCR-ABL与PTEN关系的临床观察

焦卫云，李坦，李斌，刘媛媛，胡雪莹，鲍扬漪

(合肥市第一人民医院血液科，安徽 合肥230023)

摘要：目的探讨慢性期慢性粒细胞白血病患者BCR-ABL和PTEN mRNA表达的变化及临床意义。方法观察43例慢性期慢性粒细胞白血病患者，基于6个月BCR-ABL是否下降≥10%分为两组，比较组内及组间PTEN表达水平的关系。 结果有效组患者初治时和伊马替尼治疗6个月后PTEN mRNA表达水平差异有统计学意义(P=0.031)，无效组差异无统计学意义(P=0.455)。两组患者6个月后PTEN表达水平较初治时升高倍数间差异有统计学意义(P<0.01)。治疗有效组BCR-ABL与PTEN表达水平呈负相关(r=3.174，P<0.01)。结论慢性粒细胞白血病中，PTEN表达量随着BCR-ABL水平的变化而变化，并且治疗有效组PTEN与BCR-ABL水平呈负相关。

关键词：白血病, 髓系, 慢性, BCR-ABL阳性；伊马替尼；PTEN

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种源于造血多能干细胞的常见恶性骨髓增殖性疾病，约占成人白血病的15%，好发于45～55岁的中老年患者[1]。其肿瘤细胞遗传学特征为具有Ph染色体[2-3]，其融合基因编码的蛋白引发肿瘤细胞的大量增殖。PTEN是一种重要的抑癌蛋白[4]，现认为其在体内多条通路均参与了调节作用[4-7]。近期的研究表明BCR-ABL有直接抑制PTEN的作用[8]。本试验通过观察经酪氨酸激酶抑制剂治疗后慢性粒细胞白血病慢性期患者骨髓PTEN基因变化与BCR-ABL下降水平间的关系。

1资料与方法

1.1研究对象收集2011年3月至2015年11月就诊我院，经临床症状和骨髓细胞学及遗传学确诊的初治慢性期CML患者43例，诊断标准参照《血液病诊断及疗效标准》。纳入患者治疗方式均为口服伊马替尼400 mg·d-1。留取患者骨髓标本，时间节点为两次，分别于初治时和经伊马替尼治疗6个月时。患者分组方案为基于PQ-PCR 通过特异性引物检测BCR-ABL水平，再与对照基因的转录子数量进行比较，BCR-ABL所占的比例乘以100得到的百分比，按照6个月≤10%和>10%分为两组。疾病预后相关因素选取PFS[9]，定义为疾病未进展到加速期或急变期。

1.2试剂与仪器人淋巴细胞分离液购自Solarbio公司；Trizol购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；普通PCR仪及定量PCR仪购自ABI公司；生工生物工程(上海)有限公司合成RNA引物；白血病融合基因BCR-ABL检测试剂盒(核酸扩增荧光定量法)购自上海申友生物技术有限责任公司。

1.3引物RNA引物参照GenBank中人PTEN和GAPDH 的基因序列设计，并比对哈佛引物库内引物序列，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表 1。BCR-ABL定量检测使用BCR-ABL 检测试剂盒按试剂盒说明书操作。

表1　定量扩增引物序列

1.4试验方法

1.4.1RNA提取取抗凝骨髓5 mL，经淋巴细胞分离液分离为单个核细胞，细胞悬液最终定容为(5～10)×106·L-1，加入Trizol液1 mL混匀，按照氯仿法提取细胞总RNA，RNA含量及纯度经紫外分光光度法测定。

1.4.2逆转录反应细胞总RNA提取后，采用Oligo(dT)法逆转录为cDNA，待PCR检测，具体操作见逆转录试剂盒说明书。

1.4.3实时荧光PCRPTEN实时荧光相对定量PCR反应：SYBR GREEN反应体系共25 μL；反应条件为95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，设空白对照，采用ΔΔCT相对定量法计算PTEN mRNA的相对表达量，每组重复3次取均值。BCR-ABL数据根据标准曲线分别计算出ABL 和BCR-ABL，BCR-ABL拷贝数取两次结果的平均值。

2结果

2.1患者资料及分组情况本次试验共纳入患者43例，年龄44(31±60)岁；男25例，女18例。纳入实验的患者基于6个月时BCR-ABL下降水平，≤10%为有效组，>10%为失败组，两组基线资料差异无统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2　患者基线资料及分组情况±s

2.2实时定量PCR结果患者骨髓标本PTEN表达水平由PCR仪器自带软件产生数据，以Multicomponent Plot曲线加以描述，见图1。患者初治时和伊马替尼治疗6个月后PTEN mRNA表达水平有效组差异有统计学意义(P=0.031)，无效组差异无统计学意义(P=0.455)，见图 2。两组间患者6个月后PTEN表达水平较初治时升高倍数间分别为(3.57±1.13)、(1.46±0.79)，差异有统计学意义(P<0.01)。两组间BCR-ABL与PTEN表达水平相关性分析，有效组r=3.174，P<0.01；无效组r=0.192，P>0.05，提示有效组中BCR-ABL与PTEN呈负相关。

图1PTEN的Multicomponent Plot曲线

图2PTEN mRNA的表达水平

3讨论

Ph染色体是慢性粒细胞白血病遗传学特征性表现[2-3]，9号染色体长臂上C-abl原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区(BCR)，融合为BCR-ABL基因，其编码的BCR-ABL蛋白具很强的酪氨酸激酶活性，能促使细胞过度增殖，且并不依赖细胞生长因子的参与，还可抑制细胞的黏附及凋亡，从而引发异常细胞的大量恶性增殖[10]。随着伊马替尼进入临床后，CML的治疗效果得到极大提高，伊马替尼敏感患者6～7年存活率接近100%[11]。随着治疗效果的改善，科学界更多地关注关键分子的监测，6个月BCR-ABL下降水平成为一个重要的预后判断指标[12]。

PTEN是一个高度保守的抑癌基因，其抑癌机制体现于多个方面。Peng等[13-14]发现CML小鼠的LSCs中PTEN表达被下调。通过敲除PTEN和过度表达两种手段观察，PTEN缺失情况下慢性粒细胞白血病小鼠疾病进展加速，过度表达PTEN的小鼠疾病则进展缓慢，故PTEN蛋白可能是慢性粒细胞白血病发生、发展中一种重要的蛋白分子。

本试验旨在观察BCR-ABL下降水平与PTEN在体内表达之间的关系。研究结果显示BCR-ABL被抑制后，PTEN mRNA表达水平明显上调，并与BCR-ABL抑制程度呈负相关。该结果与Morotti 等[8]和Zhou等[7]的结果类似，提示BCR-ABL可抑制PTEN水平，其机制可能与HAUSP有关，BCR-ABL介导HAUSP泛素化PTEN，促进PTEN降解，从而抑制PTEN的表达。

综上所述，BCR-ABL促进肿瘤细胞大量增殖的机制可能与PTEN活性受抑相关，反之当BCR-ABL被抑制后PTEN水平则随之升高。PTEN水平上升与疾病对伊马替尼敏感性有关，故PTEN的表达水平或许可作为一个预后因素，但需要扩大样本在蛋白水平上进一步验证。

参考文献

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[14] Peng C,Chen Y,Li D,et al.Role of Pten in leukemia stem cells[J].Oncotarget,2010,1(2):156-160.

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.041

(收稿日期：2016-01-21，修回日期：2016-03-11)