暗棕壤性苹果梨园土壤有机磷组分提取流程的优化

窦文涛，王非非，谢修鸿，程　晶，梁运江*

(1. 延边大学农学院，吉林　延吉　133002；2. 长春大学园林学院，吉林　长春　130022)

暗棕壤性苹果梨园土壤有机磷组分提取流程的优化

窦文涛1，王非非1，谢修鸿2，程晶1，梁运江1*

(1. 延边大学农学院，吉林延吉133002；2. 长春大学园林学院，吉林长春130022)

摘要：对吉林省延边州延吉市暗棕壤性苹果梨园土壤有机磷进行测定，参照熊-范改进Bowman-Cole法，对有机磷组分提取中不同条件进行优化探索。结果表明，对于酸性苹果梨园土壤，提取不同组分有机磷的优化步骤为：土壤经氯仿处理后，加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液超声波10 min，振荡30 min提取活性有机磷；再用0.1 mol·L-1NaOH溶液处理残余土壤，超声波10 min，振荡4 h提取稳定性有机磷且浸提液中无机磷为中活性有机磷，把该浸提液的酸度调至pH 3，上清液中测中稳性有机磷，沉淀中为高稳性有机磷；继续用1 mol·L-1H2SO4溶液浸提残余土样，振荡3 h，提取中活性有机磷。

关键词：苹果梨园；土壤；有机磷

土壤有机磷是土壤磷库的重要组成部分，其形态和变化对土壤供磷能力和保障植物磷素营养举足轻重，一般占土壤全磷20%～80%，高的可达95%[1-2]，主要来源于动植物和微生物残体[3]，Hedley[4]等1982 年利用一种连续浸提的技术，这个技术重要的特点是细化了在土壤循环中不可缺少的微生物磷的数量[5]。土壤有机磷分级的研究开始于20世纪60年代，其中Bowman和Cole (1978)[6]是第1个将有机磷分组体系完善的科学家。该体系将土壤有机磷分为4种形态：活性有机磷，用0.5 mol·L-1NaHCO3( pH=8.5) 浸提；中活性有机磷由溶于1.0 mol·L-1H2SO4的磷酸根和溶于0.5 mol·L-1NaOH的磷酸基团组成；中稳性有机磷(富里酸磷)；高稳性有机磷(胡敏酸磷)。随着有机农业和生态农业的发展，土壤有机磷在土壤学和植物营养学中日益受到重视[7]。其中我国学者熊恒多等[8]和范业宽等[9]对Bow man-Cole体系进行了修正，修正后的体系中，将土壤预先用氯仿处理,然后再用 0.5 mol·L-1NaHCO3(pH=8.5)处理，以提取活性有机磷。而后先用0.1 mol·L-1NaOH浸提出稳定性有机磷后,再用1.0 mol·L-1H2SO4浸提出中活性有机磷。1993年熊恒多等[8]就酸性水稻土有机磷分组进行进一步的改进。而后有学者借鉴酸性水稻土有机磷分组方法对石灰性土壤有机磷有效性分组进行过研究，研究结果[10]表明：用0.05 mol·L-1NaOH提取稳定性有机磷对石灰性土壤更合适，中稳性有机磷和高稳性有机磷较为理想的pH分界值为3.0。由于石灰性土壤的组成和性质与酸性水稻土显著不同，因此不同形态有机磷的提取条件有明显的变化。而针对北方酸性果园土壤适合的有机磷组分提取流程研究还未见报道，为此本研究以延边地区苹果梨园酸性土壤为试验材料，参照熊-范改进Bowman-Cole法[11-12]，并对试验产生的若干问题加以解决和改进，优化了提取北方酸性果园土壤不同形态有机磷的条件，为北方土壤有机磷组分提取提供参考。

1材料与分析

1.1供试土壤

供试材料为延边大学农学院果树试验基地苹果梨园土壤，2015年4月在果园中随机选取树体健康、长势良好的苹果梨树，避开施肥处，在距离树干1 m处设置采样点，采样深度为0～20 cm，其土壤类型为暗棕壤，质地为粘土，土壤的基本化学性质见表1。

表1　供试土壤基本性质

1.2试验方法

试验参照熊-范改进Bowman-Cole法[11-12]，具体步骤如下：

土样经氯仿处理后，加碳酸氢钠溶液，按0、5、10、15 min超声波处理，在振荡机上振荡30 min(250 r·min-1)，离心后上清液测定活性有机磷，重复3次；

按上面优化的时间进行超声波处理，设置0、20、25、30、35 min进行振荡，离心后上清液测定活性有机磷，重复3次；

按熊-范改进Bowman-Cole法浸提顺序，用0.1 mol·L-1NaOH浸提残余土样，按0、5、10、15 min超声波处理后，连续振荡4 h，离心后上清液测定稳定性有机磷，重复3次。

按上面优化的时间进行超声波处理，设置0、2、3、4、5 h进行振荡，离心后上清液测稳定性有机磷，重复3次。

设NaOH浓度为0.025、0.05、0.10、0.20 mol·L-1，按前面优化的超声波处理时间和振荡时间进行处理，提取上清液测稳定性有机磷，重复3次。

按熊-范改进Bowman-Cole法浸提顺序，设置上面优化的NaOH浓度、超声波处理时间和振荡时间，提取的稳定性有机磷溶液所有上清液倒在一起混匀，测定稳定性有机磷；同时取上清液50 mL于150 mL三角瓶中(或相应缩减，例如取上清液20 mL于100 mL三角瓶中)，加浓盐酸酸化分别调节至pH为1.4、1.8、2.2、2.6、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3，每个处理重复3次，静置过夜并用定量滤纸过滤出上清液。取酸化后上清液测定中稳定性有机磷；稳定性有机磷减去中稳定性有机磷含量为高稳定性有机磷含量。

将NaOH处理后的残余土样用H2SO4溶液浸提，设H2SO4浓度为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol·L-1，提取上清液测定中活性有机磷，重复3次。

按熊-范改进Bowman-Cole法浸提顺序，按上面筛选出的硫酸浓度，设置0、1、2、3、4 h振荡，提取上清液测定中活性有机磷含量，重复3次。

1.3数据处理

试验数据用Microsoft Excel SPSS 11.5软件进行处理和统计分析，采用邓肯氏新复极差法进行多重比较(α=0.05)。折线图观测点，上端用误差线表示标准误大小，不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2结果与分析

2.1活性有机磷提取参数

2.1.1活性有机磷超声波处理时间如图1所示，不加超声波处理，活性有机磷提取量最低为8.38 mg·kg-1，分析得出：各超声波处理时间段活性有机磷提取量无显著性差异, 但是为了保证超声波的足够作用时间，充分地提取活性有机磷含量，选取活性有机磷均值最高对应的10 min超声波处理时间作为试验建议处理时间。

2.1.2活性有机磷振荡处理时间如图2所示，随振荡处理时间的不断增加，与活性有机磷提取量的关系曲线呈向上倾斜M形变化。随振荡处理时间增加到20 min，活性有机磷提取含量显著上升，20～25 min振荡处理提取量无显著性差异，25～30 min振荡处理提取量显著增加，随后继续增加振荡处理时间提取量无显著性差异。另外直观上可以看出30 min振荡处理时间提取量高于35 min且30 min振荡处理时间提取量为所有时间段提取量的最高值。所以，从在活性有机磷提取量和节约能源角度来看，活性有机磷振荡处理时间最合理的时间是30 min。

2.2稳定性有机磷提取参数

2.2.1稳定性有机磷超声波处理时间如图3所示，超声波处理时间与稳定性有机磷提取的关系曲线呈不规则的倒V形变化，稳定性有机磷提取量10 min与其他时间段对比含量均显著增加，其他时段含量间无显著性差异。显而易见，活性有机磷提取量最高点为超声波处理时间10 min，提取量高达19.87 mg·kg-1。

2.2.2稳定性有机磷振荡处理时间如图4所示，振荡处理时间与稳定性有机磷关系曲线呈M形变化，分析得出：无震荡处理时间到振荡处理时间2 h，稳定性有机磷提取量显著增加。2～3 h振荡处理时间稳定性有机磷提取含量显著下降。3～4 h振荡处理时间稳定性有机磷提取含量显著上升。4～5 h振荡处理时间稳定性有机磷提取含量无显著性差异。从节约能源与时间角度来讲，应选稳定性有机磷震荡时间为4 h。

2.2.3稳定性有机磷提取液NaOH浓度如图5所示，NaOH浓度为0.025 mol·L-1时，稳定性有机磷量最少为20.18 mg·kg-1，随NaOH浓度增加到0.1 mol·L-1，稳定性有机磷提取量也显著增加，0.1 mol·L-1NaOH浓度继续增加到0.2 mol·L-1时，稳定性有机磷提取量无显著性差异。由于0.1 mol·L-1NaOH数值高于0.2mol·L-1NaOH，所以，提取稳定性有机磷NaOH浓度应选择0.1 mol·L-1。

2.3中稳定性有机磷提取参数

2.3.1中稳定性有机磷和高稳定性有机磷pH分界在高稳性有机磷中，植酸铁在pH2.5～ 8 范围内呈不溶态, pH< 2.5 或pH> 8.0 均呈可溶态，植酸铝在 pH3～ 9呈不溶态, G Anderson[12]也指出, 肌醇六磷酸铝盐在pH 值2. 9 方可沉淀完全。在中稳性有机磷中，肌醇三磷酸铁盐在pH 3.2～ 6. 2 为不溶态, 当pH< 3.2 或pH > 6.2 均为可溶态[13]，所以pH应控制在2.9～3.1。如图6所示，pH为2.8之前，中稳性和高稳性有机磷含量曲线近似2条平行线，对于酸性苹果梨园土，随pH值继续上升，溶液中产生沉淀物，高稳性有机磷和中稳性有机磷逐渐分离。当pH=3时，中稳性有机磷含量达到最高，pH继续增加中稳性有机磷含量下降，说明有中稳性有机磷从溶液中沉淀出来，所以中稳性有机磷和高稳性有机磷最高的分界为pH=3。

2.4中活性有机磷提取参数

2.4.1中活性有机磷提取液H2SO4浓度如图7所示，H2SO4浓度为0.5 mol·L-1时，中活性有机磷提取量为最低。0.75～1 mol·L-1时，中活性有机磷提取量无显著性差异，当H2SO4浓度在1～1.25 mol·L-1时，中活性有机磷提取量显著下降，H2SO4浓度增加到1.5 mol·L-1时中活性有机磷提取量无显著性差异。在H2SO4浓度为1 mol·L-1中活性有机磷提取量达到最高值，所以浸提中活性有机磷H2SO4浓度选择1 mol·L-1。

2.4.2中活性有机磷振荡处理时间如图8所示，可以看出 3 h提取量最大，最大值为108.03 mg·kg-1，分析得出除3 h外，其他时间段振荡处理提取量无显著性变化。所以，中活性有机磷振荡处理时间最合理的是3 h。

3结论

提取苹果梨园土壤有机磷4个组分的优化步骤如下：土壤经氯仿处理后，加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液超声波10 min，振荡30 min提取活性有机磷；再用0.1 mol·L-1NaOH溶液处理残余土壤，超声波10 min，振荡4 h提取稳定性有机磷，且浸提液中无机磷为较易被水解的中活性有机磷，这与前人研究结果一致。在熊-范改进Bowman-Cole法中[11-12]并未提到中稳性有机磷pH值问题，经过本研究提出把该浸提液的酸度调至pH=3，在上清液中测定中稳性有机磷含量最好，所以就北方酸性果园土壤来说，浸提中稳性有机磷pH值调至为3，沉淀为高稳性有机磷；继续用1 mol·L-1H2SO4溶液浸提残余土样，与熊-范改进Bowman-Cole[11-12]比较振荡时间增加到3小时，来提取中活性有机磷。

另外，为了保证试验的准确性以及测定液的用量，在保持水土比不变的基础上增加了称土量。为了避免反复更换玻璃仪器的污染以及繁琐的操作，将盛放容器从头到尾统一为120 mL离心管，来保证试验的准确性。

参考文献：

[1]鲁如坤.土壤-植物营养学原理和施肥[M]. 北京:化学工业出版社, 1998:162-163.

[2]文方芳,李菊梅. 不同农田管理措施对土壤有机磷影响的研究进展[J]. 中国土壤与肥料,2009,(3):10-16.

[3]王红旗,刘新会,李国学等.土壤环境学[M]. 北京:高等教育出版社, 2007:77-78.

[4]HEDLEY M J, STEWART J W B, CHAUHAN B S. C hang es ininorganic and organic soil phosphorus fraction induced bycultiv atio n practices and by laboratory incubations[J].Soil Sci Soc Am J, 1982, 46: 970-976.

[5]冯跃华, 张杨珠. 土壤有机磷分级研究进展[J].湖南农业大学学报, 2002,28(3):259-264.

[6]BOWMAN R A， COLE C V. An exploratory method forfractio nation of organic phosphorus from grassland soils[J]. Soil Sci, 1978, 125: 95-101.

[7]贺铁. 土壤有机磷研究的新进展[J]. 土壤通报,1986,(3):141-143，137.

[8]熊恒多,李世俊, 范业宽. 酸性水稻土有机磷分组法的探讨[J]. 土壤学报, 1993, 30( 4)： 390-399.

[9]范业宽,李世俊. Bow m an-Cole 石灰性土壤有机磷分组法的改进[J]. 2004,35(6):743-749.

[10]胡晓玲.石灰性土壤有机磷有效性分组法的探讨[D].华中农业大学，中国科学技术信息研究所,1997,1-36.

[11]FAN YEKUAN, LI SHIJUN. Fractionation of moderately and highly stable organic phosphorus in acid soil[J].Pedosphere，1998,8(3):261-266.

[12]熊恒多,李世俊,范业宽. 酸性水稻土有机磷分组法的探讨[J]. 土壤学报,1993,30(4):390-399.

[13]ANDERSON G. A partial fractionation of alkaline soluble soil organic phosphorus[J]. Soil Science，1961,12: 276-285.

[14]JACKMAN R H, BLACK C A. Solubility of iron， aluminum, calcium and magnesium inositol phosphat es at different pH values [J]. Soil Science，951, 72: 179-186.

(责任编辑：黄爱萍)

Optimizing Extraction Process Organic Phosphorus Fractionation from Dark Brown Soil at Apple-pear Orchards

DOU Wen- tao1, WANG Fei-fei1，XIE Xiu-hong2， CHENG Jing1,LIANG Yun-jiang1*

(1.CollegeofAgriculture,YanbianUniversity,Yanji,Jilin133002,China；2.CollegeofLandscapeArchitecture，ChangchunUniversity，Changchun,Jilin130022,China)

Abstract：Dark brow soil at the apple-pear orchards at Yanji in the Korean Autonomous Prefecture of Yanbian in Jilin province was sampled for the experimentation on organic phosphorus fractionation. The process was optimized by using the Bowman-Cole method modified by Xiong Heng-duo and Fan Ye-kuan. The fractionation included the following major steps: (1) to the acidic soil pretreated with chloroform, 0.5 mol·L-1of NaHCO3 were added with ultrasonic treatment for 10 minutes followed by oscillation for 30 minutes to extract the labile organic phosphorus into the supernatant; (2) to the soil left after the initial extraction, 0.1 mol·L-1of NaOH was added with ultrasound for 10 minutes followed by oscillating for 4 hours to leach the stable and the moderately labile organic phosphorus fractions into the alkali solution; (3) to the above alkali supernatant, acid was added to adjust the pH to 3.00 to precipitate the highly stable organic phosphorus and allow the moderately stable fraction remain in the solution; and finally, (4) to the soil, 1 mol·L-1of H2SO4 was added with a constant oscillation for 3 hours to extract the moderately labile organic phosphorus. In comparison to the existing methods, the current fractionation process on the acidic orchard soil in north China appeared to have optimized the conditions with improved efficiency.

Key words：apple-pear orchard; soil; organic phosphorus

收稿日期：2016-12-16初稿；2016-03-18修改稿

作者简介：窦文涛(1992-)，男，硕士生，现主要从事土壤与植物营养研究(E-mail: 846638941@qq.com) 共同第一作者：王非非(1991-)，女，硕士生，现主要从事土壤与植物营养研究(E-mail: 664804629@qq.com) *通讯作者：梁运江(1972-)，男，博士，副教授，现从事土壤与植物营养研究(E-mail: lyjluo@ybu.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(31460117); 延边大学第7届本科生科研立项项目(ydbksky2015052)

中图分类号：S 153.6

文献标识码：A

文章编号：1008-0384(2016)04-419-05

窦文涛，王非非，谢修鸿，等.暗棕壤性苹果梨园土壤有机磷组分提取流程的优化[J].福建农业学报，2016，31(4)：419-423.

DOU W-T，WANG F-F，XIE X-H，et al.Optimizing Extraction Process Organic Phosphorus Fractionation from Dark Brown Soil at Apple-pear Orchards[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(4)：419-423.