侧耳木霉T9对褐煤的生物降解作用

赵晓燕，吴晓青，周红姿，张广志，张新建

(山东省科学院生态研究所/山东省应用微生物重点实验室，山东　济南　250014)

侧耳木霉T9对褐煤的生物降解作用

赵晓燕，吴晓青，周红姿，张广志，张新建*

(山东省科学院生态研究所/山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014)

摘要：采用微生物降解方法，以煤样粒度、菌液用量、煤浆浓度和生物降解时间为影响因子，测定侧耳木霉T9对山西褐煤的生物降解作用。结果表明：各因素对褐煤生物降解率的影响大小依次为：煤样粒度>菌液用量>煤浆浓度>生物降解时间。采用正交试验，筛选出最优组合为：煤粒度0.1 mm、菌液用量10 mL、煤浆浓度2%和生物降解时间14 d，对褐煤的生物降解率最高达60.00%。

关键词：侧耳木霉；褐煤；粒度；生物降解率

中国的煤炭资源特别是褐煤等低质煤资源十分丰富，已探明的褐煤保有储量达1 303亿t,占全国煤炭储量的13%[1]。但褐煤的应用比较困难，中国的褐煤资源主要由于发电，但是直接燃烧不仅严重污染环境，而且也不利于实现经济效益的最大化。采用微生物对褐煤进行生物降解，具有工艺简单、低能耗、无污染和绿色环保等优点[2]，使褐煤成为清洁的燃料、化工原料和有特殊价值的化学品意义重大，因此褐煤的生物转化技术目前已成为国内外学者研究的热点。

煤的生物降解技术研究始于20世纪80年代[3-4]，虽然研究时间不长，但其发展速度很快。目前，研究者发现细菌、放线菌、真菌类中的多个种属对褐煤、风化煤等低变质煤具有生物降解作用[5-7]。真菌生物降解煤的研究主要集中在青霉、曲霉、毛霉、裂褶、云芝等种属上[8-11]。木霉是国际公认的一种高效广谱环境友好型的生防真菌，近几年国外陆续发现了几株深绿木霉生物降解褐煤的研究[12-13]。目前国内还未见木霉生物降解褐煤的报道，开展相关研究对于扩大木霉应用范围和促进褐煤的清洁转化有着重要意义。

1材料与方法

1.1煤样

褐煤取自山西临汾煤场，将煤样粉碎、筛分制成0.1、0.3、0.8 mm粒级的样品备用。用6 mol·L-1的硝酸浸泡各粒级的褐煤24 h后，真空过滤出褐煤，再用去离子水反复清洗至pH=7.0，烘干后采用紫外消毒30 min后备用。

1.2菌种

侧耳木霉TrichodermapleuroticolaT9为山东省应用微生物重点实验室保存菌种。固体培养基采用常规PDA培养基。液体培养基采用最小无机盐培养基[0.1%(NH4)2SO4，0.052% MgSO4·7H2O，0.5% KH2PO4，0.0005% FeSO4·7H2O，0.0003% ZnSO4·7H2O，0.5%葡萄糖，pH5.5]，培养基中加入6 mm玻璃珠打散菌体。菌体培养温度30℃，液体培养摇床的转速为180 r·min-1。

1.3试验方法

1.3.1种子液的制备将菌株T9从保存的PDA斜面转接至新鲜试管斜面,于30℃ 培养 12 h。取培养好的斜面,接种于盛有50 mL无菌种子培养基的 250 mL 三角瓶中，然后置于全温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，HZQ-Q)中30℃ 180 r·min-1振荡培养24 h，至活菌数为108cfu·mL-1备用。

1.3.2摇瓶培养采用正交设计方案，考查因素包括煤样粒度A、菌液用量B、煤浆浓度C、生物降解时间D。试验因素及水平如表1所示。正交试验表头设计采用L9( 34)。试验中不考虑各因素间的交互作用。每个处理都是采用250 mL的三角瓶装液量50 mL(培养液115℃高压灭菌20 min)，每个处理分别加入定量煤样和定量菌液，放入30℃全温振荡器中分别振荡培养7、14、21 d，转速180 r·min-1，每个处理重复3次，另设不加煤的培养基为对照。

表1　试验因素水平

1.3.3褐煤生物降解率计算方法参照李俊旺[14]的方法略有变动。将上述培养一定天数的褐煤培养基进行离心、过滤，从煤渣中小心挑出菌丝体，取其未溶物(煤渣)烘干、称重，按照下列公式计算褐煤生物降解率。取褐煤生物降解率最高的摇瓶进行拍照和显微镜检观察。

褐煤生物降解率/%=[(加入的煤样质量-生物降解后的煤渣质量)/加入的煤样质量]×100%

2结果与分析

2.1侧耳木霉T9生物降解褐煤的正交试验

生物降解褐煤的最佳组合为A1B2C2D2，即煤样粒度为0.1 mm，菌液用量为10 mL，煤浆浓度为2%，生物降解时间为14 d的时候，褐煤的生物降解率最大，达60.00% (表2)。

表2　L9( 34 )正交试验结果

2.2侧耳木霉T9生物降解褐煤的正交试验影响因素

各处理摇瓶培养14 d后的培养液和菌体颜色都发生了变化。褐煤对照培养液(不加T9)培养14 d后颜色仍然为不透明的纯黑色(图1-C)，褐煤生物降解14 d后培养液的黑色变淡变透明，且明显能看到褐煤上面长出了绿色的侧耳木霉T9(图1-A)，T9对照培养液中聚集的菌体为绿色(图1-B)，通过上述的颜色对比上就能直观看出T9对褐煤具有生物降解作用。

各处理摇瓶培养14 d对菌丝分别进行显微镜检。从T9降解褐煤14 d(图2-A)和T9对照 (图2-B)的显微图片对比中，能够明显看出T9生物降解褐煤14 d后菌丝体上富集了很多黑色的褐煤，菌体也因为吸收褐煤开始变为黑色，而T9对照中的菌丝在显微镜下为透明中空状，从显微镜检结果也能明显看出T9对褐煤的生物降解作用。

煤样粒度、菌液用量、煤浆浓度和生物降解时间与T9生物降解率的关系见图3～6。T9生物降解率随着煤样粒度的增加下降趋势明显(图3)，说明煤样粒度对生物降解率影响很大，粒度越大越难生物降解。T9生物降解率随菌液用量的变化呈先升高后降低的趋势(图4)，当菌液用量为10 mL的时候，T9生物降解率最高达43.61%，随后逐渐减少。煤浆浓度与T9生物降解率之间的关系总体来看也是先增后减的趋势(图5)，当煤浆浓度达到2%的时候，T9生物降解率最高，为43.06%，随后生物降解率呈缓慢下降的趋势。降解时间与T9生物降解率的关系也是先增后减(图6)，降解时间为14 d时，T9生物降解率最高达41.56%，随后降解率呈下降趋势，这可能是因为随时间的延长T9生长所需要的营养物质逐渐减少导致生物降解率逐渐降低。

3讨论与结论

通过正交试验优化出T9降解褐煤的最佳组合为A1B2C2D2，各因素对褐煤微生物降解率的影响大小依次为煤样粒度>菌液用量>生物降解时间>煤浆浓度。图3～6中可以看出煤的粒度对生物降解的影响最大,粒度越大生物降解越难,这可能是因为煤粒度越大孔隙度越小,微生物释放的各种活性物质和煤的接触面积就越小,煤的溶解程度和生物降解速率也越小。菌液用量是褐煤微生物降解率的第二大影响因素，但菌液用量并非越多越好，这可能与菌种互相之间的空间竞争和营养竞争有关系，菌量过多造成培养后期生长缓慢，造成T9对褐煤的生物降解率降低。煤浆浓度关系到液体培养基中的碳源含量的高低，褐煤为T9的生长提供了碳源，但当煤浆浓度过高时，T9消耗不了的褐煤反而会占据菌体的生存空间进而影响到褐煤的生物降解率。

目前对于煤生物降解方法的前处理多采用硝酸氧化和盐酸氧化的方法[15-16]，前处理的目的是提高煤炭的含氧量，有利于微生物产生的各种酶能断开煤结构中的化学键，进一步促进微生物对煤的降解。本研究中也采用了硝酸对褐煤进行前处理，对环境有一定的污染性[17]，导致该方法只能局限于实验室内的研究而无法大面积的推广应用。本研究从摇瓶培养和显微镜检(图1和图2)两方面的结果表明侧耳木霉T9对褐煤具有富集和生物降解的双重作用。T9的富集作用未来也可应用于褐煤水体污染方面的研究，这为褐煤的水污染的处理提供了一种新的方法和途径。

褐煤是由芳香环组成并由盐桥、脂肪链等连接起来的大分子网状结构化合物，一般很难进入微生物细胞内。褐煤的生物降解主要是靠微生物分泌到细胞外的一些活性物质起作用，不同的微生物代谢产物也不同，迄今研究者主要提出了3种煤的微生物降解机理，包括碱作用机理、生物螯合剂作用机理及酶作用机理[18]。国外有报道表明木霉对褐煤的生物降解机理是酶的作用。Laborda F等发现在含煤培养基中生长起来的木霉菌丝体的溶解作用是由于菌体细胞的存在而促进了煤的溶解，也就是说，木霉对褐煤的生物降解作用是胞外酶和细胞壁共同作用的结果[19]。本试验仅研究了侧耳木霉T9对褐煤的初步生物降解作用，至于T9对褐煤的生物降解机理是否也是酶作用机理，或是酶与细胞壁的共同作用有待于以后进一步的研究。

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(责任编辑：林海清)

iodegradation of Lignite byTrichodermapleuroticolaT9

ZHAO Xiao-yan, WU Xiao-qing, ZHOU Hong-zi, ZHANG Guang-zhi, ZHANG Xin-jian*

(ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedMicrobiology,InstituteofEcology,ShandongAcademyofSciences,Ji′nan,Shandong250014,China)

Abstract：Biodegradation by Trichoderma pleuroticola T9 on lignite from Shanxi province was studied aiming to optimize the process in regard to the particle size and slurry concentration of the coal, as well as the inoculum quantity and fermentation time. The results indicated that the biodegradation was affected in the order of particle size >inoculum quantity>concentration of coal slurry>duration of fermentation. The optimized conditions to achieve the maximum degrading rate of 60% were determined to be (a) a use of lignite with a particle size of 0.1 mm, (b) a coal slurry concentration of 2%, (c) the inoculation of 10 mL of T. pleuroticola T9 fermentation broth, and (d) incubation for 14 d.

Key words：Trichoderma pleuroticola; lignite; particle size; biodegradation rate

收稿日期：2016-03-08初稿；2016-04-01修改稿

作者简介：赵晓燕(1978-)，女，硕士，助理研究员，研究方向：面源污染修复与生物防治 *通讯作者：张新建(1978-)，男，博士，副研究员，研究方向：面源污染修复与生物防治(E-mail: zhangxj@sdas.org)

基金项目：国家自然基金项目(31572044 )；山东省优秀中青年科学家科研基金项目(BS2015SW029)；山东省科学院青年基金项目(2014QN019)；山东省科技攻关项目(2014GSF121028)

中图分类号：S 476

文献标识码：A

文章编号：1008-0384(2016)04-415-04

赵晓燕，吴晓青，周红姿，等.侧耳木霉T9对褐煤的生物降解作用[J].福建农业学报，2016，31(4)：415-418.

ZHAO X-Y，WU X-Q，ZHOU H-Z，et al.Biodegradation of Lignite byTrichodermapleuroticolaT9[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(4)：415-418.