液相色谱质谱法测定乳品中动物水解蛋白的含量

侯文慧

摘 要：采用液相色谱质谱法测定乳品中动物水解蛋白的含量，样品经牛蛋白酶酶解，乙腈萃取，HLB柱净化，C18色谱柱分离，MRM模式，定量离子对（m/z）：132.1/86.2；定性离子对（m/z）：132.1/68.3。结果表明：回收率在92.18%～98.57%，相对标准偏差2.1%～4.8%；按信噪比RSN=3计算，定量限为2.5μg/kg。

关键词：液相色谱-串联质谱法；L-羟脯氨酸；乳品

中图分类号 TS252.7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）11-0134-02

Determination of L-Hydroxyproline in Dairy products by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

Hou Wenhui

（Ulanqab Vocational College，Wulanchabu 012000，China）

Abstract：A method for determining the residues of L-Hydroxyproline in dairy products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was enzymatic digest of bovine，and ultrasonic extracted with ethyl acetate，and purified with HLB solid phase extraction cartridge，and separated by UPLC BEH C18 column，and quantitative analysis was performed by the multi-reaction-monitoring （ MRM） mode.The qualitative ion pair （m/z） was 132.1/86.2；the quantitative ion pair （m/z） was 132.1/68.3.The results show that the recoveries were between 92.18%～98.57%，and the relative standard deviation were between 2.1%～4.8%；According to RSN=3，the limit of quantificationn was 2.5μg/kg.

Key words：Liquid chromatography tandem mass spectrometry；L-Hydroxyproline；Dairy products

乳品中掺入动物水解蛋白是提高其蛋白质含量的主要掺假手段，而动物水解蛋白是由动物皮革及其制品下脚料等水解得到的蛋白质，长期误食，可导致关节疏松、肿大，造成重金属中毒。卫生部《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》中明确要求：乳及乳制品、含乳饮料中不得添加水解动物蛋白。动物水解蛋白中特征性氨基酸是L-羟脯氨酸，而乳蛋白质中不含L-羟脯氨酸。为此，L-羟脯氨酸已作为检测乳及乳制品中是否非法掺入动物水解蛋白的重要标示物。

目前，针对动物水解蛋白的测定方法有分光光度法[1]、液相色谱法[2-3]等，而关于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定乳品中动物水解蛋白含量的研究较少。为此，本文以乳品为研究对象，建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定乳品中动物水解蛋白含量的分析方法，为其检验检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪（Waters Acquity UPLC Quattro Premier XE，美国沃特世公司）；电子分析天平（XS-205型，赛多利斯北京有限公司）、超纯水器（Milli-Q型，美国Millipore公司）。L-羟脯氨酸标准品（CAS号：51-35-4），纯度≥99.5%，购自上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈、甲醇、正己烷（色谱纯，德国默克公司）。所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂，水为超纯水。

1.2 仪器工作条件 色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×150mm，1.7μm）色谱柱；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1%甲酸水（体积比10：90）；流速：0.2mL/min。质谱条件：电喷雾电离，ESI（+）；监测方式：MRM；源温度：150℃；脱溶剂气：氮气，600L/Hr，350℃；锥孔气：氮气，45L/Hr；碰撞气：氩气；喷雾电压：2.5kv；定性离子对（m/z）：132.1/68.3；定量离子对（m/z）：132.1/86.2；锥孔电压：20V；碰撞电压：25V。

1.3 样品前处理 精确称取试样2g置于50mL塑料离心管中，加入100mmol/L甲酸铵溶液5mL和牛蛋白酶液50μL，涡旋2min，50℃酶解3h，加入5mL乙腈，振荡2min，10 000r/min 离心10min，上清液用HLB小柱净化，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4mL清洗上述离心管，并将清洗液依次过柱，收集全部流出液体，35℃水浴氮气吹至近干，准溶解定容后过滤，供LC-MS分析。

1.4 标准曲线绘制 取空白基质试样6份，分别加入适量的标准工作溶液，制备成含L-羟脯氨酸浓度依次为5μg、10μg、20μg、50μg、100μg/kg，按1.2节和1.3节操作，以特征离子色谱峰面积为纵坐标，L-羟脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化 L-羟脯氨酸是弱酸性化合物，故采用正离子模式扫描。将L-羟脯氨酸标液注入质谱检测器，进行一级质谱扫描，得到m/z为132.1的准分子离子峰[M+H]+，优化锥孔电压等参数使分子离子峰达到最大强度；对分子离子峰进行碰撞碎裂优化，选择MRM模式，离子源温度为150℃，碰撞气为氩气，锥孔电压为30V，碰撞电压为30V，进行子离子扫描分析，得到其碎片离子（图1），定量离子对（m/z）132.1/86.2；定性离子对（m/z）132.1/68.3。在上述质谱条件下，LC-MS总离子流图中，L-羟脯氨酸色谱图峰型对称尖锐，峰型良好，无明显的干扰峰（图2）。

3 結论

动物水解蛋白是由动物皮革及其制品下脚料等水解得到的蛋白质，长期误食，可导致关节疏松、肿大，造成重金属中毒，目前L-羟脯氨酸已作为检测乳及乳制品中是否非法掺入动物水解蛋白的重要标示物。本文建立了液相色谱质谱法测定乳品中动物水解蛋白的含量，该法准确度高、灵敏度好，可为乳品检验检测提供实际的检测技术参考。

参考文献

[1]赵天珍，袁秀金，谭贵良，等.比色法快速测定奶粉和含乳饮料中游离L-羟脯氨酸[J].食品研究与开发，2008，29（12）：111-113.

[2]李景红，孟祥晨.高效液相色谱法检测牛乳中掺加的胶原水解蛋白[J].中国乳品工业，2008，36（11）：56-59.

[3]胡华，吕定，杜青，等.高效液相色谱法检测酱油中羟脯氨酸的含量[J].中国调味品，2010，35（4）：106-109. （责编：张宏民）