乳腺癌中HER-2基因多态性与蛋白表达的相关性研究

苏永辉，姜永冬，谢静静，庞达哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，黑龙江 哈尔滨 150081



乳腺癌中HER-2基因多态性与蛋白表达的相关性研究

苏永辉，姜永冬，谢静静，庞达
哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，黑龙江 哈尔滨 150081

［摘要］背景与目的：致病基因的多态性可能会影响该基因的功能，从而引起个体肿瘤易感性的差异和个体内生物活性物质效应的改变。本研究旨在研究HER-2基因多态性与其蛋白表达的关系，并分析其与乳腺癌临床病理特征的相关性。方法：收集303例汉族女性乳腺癌患者为研究对象，运用MassARRAY技术平台检测HER-2基因rs2517954和rs2517955单核苷酸多态性。同时采用免疫组织化学法检测相应乳腺癌组织中HER-2蛋白表达并检测雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、P53及Ki67表达。以Pearson χ2分析这两个位点和其蛋白表达的关系，并分析其与乳腺癌临床病理特征的相关性。结果：在共显性模型下，HER-2基因rs2517954和rs2517955位点多态性与其蛋白表达相关（χ2=9.613，P=0.008；χ2=9.613，P=0.008）。在显性模型下，HER-2基因rs2517955位点TT纯合突变型和CT杂合突变型的频率与其蛋白表达相关（χ2=8.894，P=0.003）。HER-2基因rs2517954和rs2517955位点多态性与患者的临床分期、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、ER、PR、Ki67及P53表达均无显著相关性（P＞0.05）。结论：HER-2基因rs2517955多态性位点与其蛋白表达具有相关性，对该位点进一步研究可能有助于阐明乳腺癌中HER-2蛋白的表达机制。

［关键词］乳腺癌；HER-2基因；基因多态性；rs2517954；rs2517955

Correspondence to: PANG Da E-mail: pangdasir@163.com

HER-2基因定位于17号染色体上，编码跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性，能促进细胞分裂、细胞增殖和细胞转化［1］。HER-2蛋白由HER-2基因编码，其在乳腺癌细胞中过表达，与肿瘤的侵袭性表型、生存期短及对内分泌药物的耐药现象相关［2］。致病基因的多态性可能会影响该基因的功能，从而引起个体肿瘤易感性的差异和个体内生物活性物质效应的改变。有研究显示，HER-2基因655位密码子（Ile655Val）多态性可能增加乳腺癌的易感性，但不同的研究结果尚存在分歧［3-5］。同时，Ile655Val多态性与HER-2阳性乳腺癌使用靶向药物曲妥珠单抗治疗所致的心脏不良反应相关［6］。但是，目前尚无关于HER-2基因多态性与HER-2蛋白表达的相关报道。本文通过MassARRAY方法检测303例原发性乳腺癌患者HER-2基因rs2517954和rs2517955位点多态性，研究这两个位点和其蛋白表达的关系，并分析其与乳腺癌临床病理特征的相关性，以探讨其在乳腺癌发病中的潜在价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科2011 年3月—2011年12月收治的原发性乳腺癌患者303例，均为汉族女性，均经病理证实，且入组前均未接受任何抗癌治疗。本研究由哈尔滨医科大学研究伦理委员会审查认可，所有患者均签署知情同意书，同时收集患者的临床信息。

1.2 免疫组织化学法检测

采用免疫组织化学法对乳腺癌组织蜡块标本进行雌激素受体（estrogen receptor，ER)、孕激素受体（progesterone receptor，PR)、HER-2、Ki67和P53检测。ER和PR可见明显的细胞核着色，且≥10%为阳性，无着色或阳性肿瘤细胞数＜10%和着色弱且阳性肿瘤细胞数＞10%为阴性。HER-2可见细胞膜着色，≥30%肿瘤细胞呈现强而完整均匀的细胞膜着色为阳性，无着色或阳性肿瘤细胞数＜10%和着色弱且阳性肿瘤细胞数＞10%为阴性。Ki67、 P53标记阳性结果为肿瘤细胞的细胞核呈棕黄色或棕褐色颗粒，Ki-67判断标准：阳性细胞数≥14%为阳性，＜14%为阴性；P53判断标准：阳性细胞数≥10%为阳性，＜10%为阴性。

1.3 DNA提取和引物设计

抽取乳腺癌患者清晨空腹外周EDTA抗凝血样本2 mL，采用爱思进生物技术（杭州）有限公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA，-80 ℃保存。

引物设计由华大基因公司按照MassARRAY分子量阵列分析系统的要求，利用Assay Designer引物设计软件设计相应的引物及探针并合成。

1.4 基因型检测

提取纯化后的基因组DNA样品定量稀释至100 ng/μL，按设计顺序每孔加1 μL样品于384孔板上，然后添加PCR扩增体系使反应物的终浓度如下：0.5 U的Taq聚合酶，100 ng基因组DNA，各0.1 pmol的PCR引物，500 μmol的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）。PCR反应条件为：94 ℃ 15 s；94 ℃20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(45 个循环)；72 ℃3 min，4 ℃保存。添加0.3 U的虾碱性磷酸酶去除剩余的dNTP。在384孔中加入2 μL单碱基延伸反应液及适量引物，进行单碱基延伸反应。反应条件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s（40个循环）；72 ℃ 3 min。反应产物用树脂脱盐60 min后经自动点样仪点样于SpectroCHIP（Sequenom）芯片。点样后的芯片使用MassARRAY Analyzer Compac进行质谱检测。结果使用Typer4.0软件分型。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行统计学处理。检验HER-2基因rs2517954和rs2517955位点基因多态频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，以Pearson χ2分析这两个位点基因多态性与HER-2蛋白表达和乳腺癌临床病理学参数的相关性。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检测

HER-2基因rs2517954位点CC、CT和TT三种基因型频率分别为18.8%、54.8%和26.4%，分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.07)。rs2517954位点CC、CT和TT三种基因型频率分别为26.4%、54.8%和18.8%，分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.07)。

2.2 HER-2基因rs2517954和rs2517955位点与HER-2蛋白表达的关系

在共显性模型下，HER-2基因rs2517954位点基因型多态性与HER-2蛋白表达之间具有显著相关性(χ2=9.613，P=0.008)。在显性模型下，rs2517954 的CC纯合野生型患者HER-2蛋白表达阳性率为26.3%(26/99)，TT纯合突变型和CT杂合突变型患者HER-2蛋白表达阳性率为73.7%(73/99)，两组差异无统计学意义(χ2=2.899，P=0.089，表1)。在共显性模型下，HER-2基因rs2517955位点基因型多态性与HER-2蛋白表达之间具有显著相关性(χ2=9.613，P=0.008)。在显性模型下，rs2517955的CC纯合野生型患者HER-2蛋白表达阳性率为15.2%(15/99)，而TT纯合突变型和CT杂合突变型患者HER-2蛋白表达阳性率为84.8%(84/99)，两组差异有统计学意义(χ2=8.894，P=0.003，表1)。

2.3 HER-2基因rs2517954和rs2517955位点与乳腺癌临床病理特征的关系

HER-2基因rs2517954和rs2517955位点多态性与患者的临床分期、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、ER、PR、Ki67及P53表达均无显著相关性(P均＞0.05，表2、3)。

表1　HER-2基因rs2517954和rs2517955位点与其蛋白表达的关系Tab.1 The relationship between HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 loci and protein expression

表2　rs2517954与乳腺癌临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between rs2517954 and clinicopathological characteristics of breast cancer

表3　rs2517955与乳腺癌临床病理特征的关系Tab.3 The relationship between rs2517955 and clinicopathological characteristics of breast cancer

3 讨 论

HER-2蛋白由原癌基因HER-2编码，是结合在细胞膜表面的受体酪氨酸激酶，参与细胞生长和分化的信号转导途径。研究表明，在15%~20%的乳腺癌中可以检测到HER-2蛋白的过表达［7］。转染HER-2基因的哺乳动物细胞系，DNA合成增强，细胞生长速度加快，侵袭性增强，并且在裸鼠体内成瘤性及转移能力增强［8］。临床上HER-2蛋白过表达的乳腺癌患者往往表现出生存率低、肿瘤恶性程度增强、进展迅速、易于发生转移、化疗缓解期短及对三苯氧胺和细胞毒性化疗药耐药等特点［7，9］。

目前关于HER-2基因多态性的研究主要在于HER-2基因655位密码子多态性的研究，该位点突变可导致异亮氨酸置换为缬氨酸，从而引起蛋白质结构的改变，可能与乳腺癌的易感性相关［10］，其结果尚存在分歧［3-5，11］。同时该位点的多态性与乳腺癌经不同方案治疗的预后相关［12］。HER-2基因rs903506位点与突尼斯人乳腺癌的易感性相关［11］。本文所研究的rs2517954和rs2517955位点均位于HER-2基因的启动子区域，查询Hapmap数据库，rs2517954位点在北京地区汉族人群中CC、CT和TT基因型的频率分别为29.5%、43.2%和27.3%；rs2517955位点在北京地区汉族人群中CC、CT和TT基因型的频率分别为22.0%、61.0%和17.1%。这两个位点基因型的频率与本组实验所得数据略有差异，可能与实验样本量和研究人群特异性有关。本实验发现，在共显性模型下rs2517954和rs2517955位点不同基因型(CC、CT 和TT基因型)与乳腺癌中HER-2蛋白表达相关。且在显性模型下，rs2517955位点TT纯合突变型和CT杂合突变型的频率与HER-2蛋白表达呈正相关。这种蛋白表达差异的机制尚不清楚。我们推测rs2517955位点可能是转录因子结合位点，其基因型的改变可能通过影响DNA的转录，从而影响HER-2蛋白的表达。但是，HER-2基因多态性如何调控蛋白表达的机制，尚需进一步的研究证实。

乳腺癌中HER-2蛋白的过表达往往与乳腺癌的组织学分级［13］及ER和PR的表达状况［14］等临床病理特征相关。而本研究结果显示，HER-2基因rs2517954和rs2517955位点多态性与患者的临床分期、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、ER、PR、Ki67及P53表达均无显著相关性。

综上所述，HER-2基因2517955位点多态性与乳腺癌HER-2蛋白的表达具有相关性，对该位点的进一步研究可能有助于乳腺癌患者HER-2状态评估，也有利于阐明乳腺癌中HER-2蛋白的表达机制。

［参 考 文 献］

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Association between HER-2 gene polymorphism and protein expression in breast cancer

SU Yonghui，JIANG Yongdong， XIE Jingjing， PANG Da （Department of Breast Cancer Surgery， Harbin Medical University Cancer Hospital， Harbin 150081， Heilongjiang Province， China）

［Key words］Breast cancer； HER-2 gene； Gene polymorphism； rs2517954； rs2517955

［Abstract］Background and purpose: Pathogenic gene polymorphism may affect the function of gene，leading to the difference of individual tumor susceptibility and heterogeneity of bioactive substances in individuals.The purpose of this study was to investigate the interrelationship between HER-2 gene polymorphism and its protein expression， and to evaluate their association with the clinicopathological characteristics of breast cancer.Methods: The data from a total number of 303 female breast cancer patients of Han ethnicity were collected.The MassARRAY platform was used to examine HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 single nucleotide polymorphisms.Meanwhile immunohistochemistry was used to detect HER-2 protein expression and corresponding estrogen receptor （ER），progesterone receptor （PR）， P53 and Ki-67 expressions in breast cancer tissues.Pearson chi-square test was used to study the relationship of the two loci and the protein expression， and their correlation with clinicopathological features of breast cancer was analyzed.Results: Under the codominant model， HER-2 gene rs2517954 and rs2517955 loci polymorphisms were associated with its protein expression （χ2=9.613, P=0.008； χ2=9.613, P=0.008）.And under the dominant model， HER-2 gene rs2517955 loci TT homozygous and CT heterozygous mutant was associated with its protein expression （χ2=8.894, P=0.003）.There were no significant correlations between HER-2 gene rs2517954， and rs2517955 loci polymorphisms， and breast cancer patients’ clinical stage， tumor size， histological grade， lymph node metastasis， ER， PR， Ki-67 and P53 expressions （P>0.05).Conclusion: HER-2 gene rs2517955 loci polymorphism is correlated with its protein expression.Further studies may be helpful to elucidate the mechanism of HER-2 protein expression in breast cancer.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.004

中图分类号：R737.9

文献标志码：A

文章编号：1007-3639(2016)02-0140-05

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81202075）；哈尔滨医科大学“中俄”合作医学转化基金（CR201402）。

通信作者：庞达 E-mail：pangdasir@163.com

收稿日期：（2015-01-04 修回日期：2015-06-07）