保加利亚乳杆菌增殖培养基的优化研究

王月囡

（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山　114007）



保加利亚乳杆菌增殖培养基的优化研究

王月囡

（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山114007）

摘要：通过研究保加利亚乳杆菌在优化MRS培养基和增殖培养基的增菌效果，进一步采用正交试验优化筛选保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480的增殖培养基。试验结果表明，在MRS培养基中添加0.6%果糖、0.4%蛋白胨、0.08%ZnSO4时，保加利亚乳杆菌菌体数为4.05×108CFU/mL；在优化MRS液体培养基中添加7.5%番茄汁、2.5%平菇汁、1.0%绿豆芽汁、4.0%啤酒时，保加利亚乳杆菌菌体数达到最高为7.82×108CFU/mL，较优化前的1.16×108CFU/mL提高了6.74倍，终点pH值为4.03。

关键词：保加利亚乳杆菌；促生长物质；增殖培养基

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）是一种乳酸菌类益生菌，是人体肠道中的重要微生物［1-2］。乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改进食品的品质和营养，还具有维持微生态环境、抗突变、抗肿瘤、降血脂和提高免疫力等重要功能［3］，因此一直是食品界、医药界和微生态学界关注的热点。

近年来，随着人民生活水平的提高和健康意识的增强，我国发酵乳制品工业迅猛发展［4］。牛乳是国际公认几乎全价的理想食品，酸奶以其独特的风味和特有的保健功能越来越受到人们的喜爱，酸奶产量正以每年25%的速度递增［5］，这对酸奶发酵剂的品质、特性、种类提出了新的要求。目前，一些企业已开始使用国外进口的冻干酸奶发酵剂，但冻干菌种价格昂贵，国产冻干菌活菌含量较低。要提高冻干菌活菌数，必须提高冻干菌悬液的质量分数，培养基中生长因子的选择添加是其基础和关键［6-7］。因此，根据我国国情和资源优势，积极寻求来源广泛、经济易得的廉价原料，优化筛选适合乳酸菌大量生长的增殖培养基，是实现我国大规模工业化生产浓缩型乳酸菌发酵剂的重要研究课题之一。

本研究以保加利亚乳杆菌为研究对象，根据乳酸菌生长增殖的营养物质需要，对其发酵培养基成分中的氮源、碳源、无机盐及增殖因子进行选择，并运用正交分析方法对各成分的配比进行优化，得到最佳培养基，为保加利亚乳杆菌活菌制剂产品的开发奠定基础。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

1.1.1菌种

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）L.b- 1.1480，购于中科院微生物研究所。

1.1.2培养基

活化培养基采用10%脱脂乳，种子和传代培养基采用MRS液体培养基。

酪蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖5 g，乙酸钠5 g，吐温80 1 g，柠檬酸氢二胺2 g，磷酸氢二钾0.2 g，七水硫酸镁0.2 g，一水硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.2～6.4，于121℃条件下灭菌20 min；计数培养基：在MRS液体培养基的基础上添加1.8%琼脂。

1.1.3生长因子的制备

（1）番茄汁的制备［8］。将新鲜番茄洗净，用组织捣碎机捣碎榨汁，加1倍的水浸泡洗涤1次，经过滤，将2次滤液混合，置于冰箱备用。

（2）平菇汁的制备［9］。取鲜平菇200 g，切碎后加400 mL蒸馏水煮沸5 min，移入组织捣碎机捣碎，用3层纱布过滤，滤液即为平菇汁，备用。

（3）绿豆芽汁的制备［8］。将新鲜绿豆芽去根后洗净，加等量水煮沸30 min，用组织捣碎机捣碎，过滤后离心10 min，分装于瓶中，置于冰箱中备用。

（4）啤酒。啤酒放气后置于冰箱中备用。

1.1.4主要仪器设备

PB- 10型数字酸度计，DHP- 120型恒温培养箱，PHX- 150H型智能生化培养箱，T6新世纪型普析紫外分光光度计，YXQ- LS- 30SII型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，CJ- 1S型洁净工作台，PL2002型电子天平。

1.2试验方法

1.2.1斜面种子活化

取斜面贮藏菌株接种于新鲜斜面，于37℃条件下培养。

1.2.2种子培养

取1～2环活化的斜面种子接入装有100 mL基础培养基的250 mL三角瓶中，于37℃条件下静置培养24 h。

1.2.3增殖培养

以1%的接种量将种子液接入装有100 mL增殖培养基的250 mL三角瓶中，于37℃条件下培养16 h。

1.2.4乳酸菌活菌计数

取1 mL增殖培养液加入到9 mL无菌生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取3个适当的稀释倍数，吸取1 mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15 mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做3个平行培养皿。待培养基凝固后，于30℃条件下倒置培养24 h。选取菌落数在30～300 CFU/mL的培养皿进行菌落计数。

1.2.5菌体质量分数（OD600）测定

采用紫外分光光度计测定，波长600 nm，增殖培养液稀释至合适倍数，以相应增殖培养基为空白。

1.2.6pH值的测定

采用PB- 10型数字酸度计直接检测。

1.2.7生长曲线的测定

菌种经活化扩培后，按1%接种量接种于优化的增菌培养基中，于37℃条件下培养，每2 h进行1次活菌计数，同时测定发酵液的pH值及OD600值，以便更准确地掌握其生长情况。

以培养时间为横坐标、相应的活菌数为纵坐标，绘制生长曲线，同时测定增菌培养基中pH值的变化。

1.3不同碳源、氮源、无机盐的选择

依据基础培养基，分别添加0.5%蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖作为碳源；添加1%蛋白胨、氯化铵、硫酸铵作为氮源；分别添加0.1%硫酸锌作为无机盐，其他组分均相同。在培养基中接入保加利亚乳杆菌，于37℃条件下静置培养16 h，平板计数测定菌体质量分数，比较其对保加利亚乳杆菌生长的影响。

1.4增殖因子对保加利亚乳杆菌的影响

在基础培养基中分别加入增殖因子（番茄汁、平菇汁、绿豆芽汁、啤酒），并依次按1%，2.5%，4.0%，5.5%，7.0%进行添加，培养16 h后测定培养液pH值、OD600值和活菌总数。

2　结果与分析

2.1保加利亚乳杆菌生长曲线的确定

了解L.b- 1.1480在MRS优化培养基和增殖培养基中的生长过程，从而掌握发酵最适收获期，并进行生长曲线测定。以2%的接种量，于37℃条件下恒温培养箱中培养，间隔2 h测定菌液的OD600值及pH值，间隔4 h测定菌液的活菌数，可得结果绘制生长曲线和pH值变化曲线。

保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480菌株在MRS优化培养基和增殖培养基中OD600值的变化曲线见图1，保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480在MRS优化培养基和增殖培养基中的生长曲线见图2。

图1　保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480菌株在MRS优化培养基和增殖培养基中OD600值的变化曲线

由图1和图2可知，在MRS优化培养基和增殖培养基中，保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480延迟期较短，迅速进入对数生长期，菌体生长速率和酸度上升速率同时加快，培养至16 h，基质OD600值和活菌数均达到最高，活菌数分别为1.16×108CFU/mL和7.46×108CFU/mL，之后进入稳定生长期，OD600值和活菌数趋于平稳。因此，L.b- 1.1480的最适收获期应为16 h。

图2　保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480在MRS优化培养基和增殖培养基中的生长曲线

2.2添加不同的生长因子对L.b- 1.1480的影响

MRS培养基中添加不同生长因子对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响见表1。

表1　MRS培养基中添加不同生长因子对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响

由表1可知，果糖、蛋白胨、硫酸锌对保加利亚乳杆菌的增菌效果最佳，根据进一步试验确定果糖、蛋白胨、硫酸锌的最佳添加量。

MRS培养基中添加不同质量分数的生长因子对L.b- 1.1480生长的影响见表2。

表2　MRS培养基中添加不同质量分数的生长因子对L.b- 1.1480生长的影响

由表2可知，L.b- 1.1480在以0.5%～0.6%果糖质量分数为碳源、0.4%～0.6%的蛋白胨为氮源、0.08% ～0.10%的硫酸锌为无机盐时生长较好，更好地被L.b- 1.1480利用，因此确定L.b- 1.1480最佳碳源为0.5%～0.6%果糖，最佳氮源为0.4%～0.6%的蛋白胨，最佳无机盐为0.08%～0.10%的硫酸锌。

2.3增殖因子最佳质量分数的确定

不同增殖因子对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响见表3。

表3　不同增殖因子对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响

由表3可知，番茄汁、平菇汁、绿豆芽汁和啤酒对L.b- 1.1480的生长均具有促进作用。平菇汁的促生长作用较为明显，活菌数达5.30×108CFU/mL，较对照组MRS培养基活菌数提高了3.31倍，而加入其余3种生长因子的活菌数，也较对照组活菌数分别提高了3.04倍和2.96倍。根据进一步试验，确定平菇汁、绿豆芽汁、番茄汁和啤酒的最佳添加量。

2.4增殖因子保加利亚乳杆菌生长L.b- 1.1480的影响

2.4.1番茄汁的添加量

不同质量分数的番茄汁对保加利亚乳杆菌L.b-1.1480生长的影响见表4。

表4　不同质量分数的番茄汁对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响

由表4可知，当加入番茄汁的质量分数为7.5%时，OD600值最大，平板计数测得的活菌数为5.18× 108CFU/mL。

2.4.2平菇汁添加量

不同质量分数的平菇汁对保加利亚乳杆菌L.b-1.1480生长的影响见表5。

表5　不同质量分数的平菇汁对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响

由表5可知，当加入平菇汁的质量分数为5.0%时，吸光度最大，平板计数测得的活菌数为5.35×108CFU/mL。

2.4.3绿豆芽汁的添加量

不同质量分数的绿豆芽汁对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响见表6。

表6　不同质量分数的绿豆芽汁对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响

由表6可知，当加入绿豆芽汁的质量分数为2.5%时，吸光度最大，平板计数测得的活菌数为5.70×108CFU/mL。

2.4.4啤酒的添加量

不同质量分数的啤酒对保加利亚乳杆菌L.b-1.1480生长的影响见表7。

表7　不同质量分数的啤酒对保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480生长的影响

由表7可知，当加入啤酒的质量分数为2.5%时，吸光度最大，平板计数测得的活菌数为5.81× 108CFU/mL。

2.4.5增殖培养基的正交优化

根据单因素试验结果，以在改良MRS液体培养基中添加番茄汁（A）、平菇汁（B）、绿豆芽汁（C）、啤酒（D）为4个因素，每个因素3个水平为A（%）：1（5），2（7.5），3（10）；B（%）：1（2.5），2（5），3（7.5）；C（%）：1（1），2（2.5），3（4）；D（%）：1（1），2（2.5），3（4），采用L9（34）正交试验设计配制9种培养基，优化L.b- 1.1480增殖培养基。将活化后的L.b- 1.1480按1%的接种量加入上述生长培养基，于37℃左右条件下的培养箱中培养24 h。

保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480增殖培养基正交试验设计及数据处理见表8。

由表8极差R大小可知，影响菌液活菌数的主要因素主次顺序为A＞C＞B＞D，即番茄汁添加量的增菌效果最显著，其余因素的影响大小依次为绿豆芽汁、平菇汁和啤酒的添加量。通过对表8的直观分析，可得出增殖因子的最优组合为A2B1C1D3。因此，确定增殖因子的最佳组合为7.5%番茄汁+ 2.5%平菇汁+ 1.0%绿豆芽汁+ 4.0%啤酒，以此作为增殖因子的添加量。

表8　保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480增殖培养基正交试验设计及数据处理

3　结论

本试验确定了保加利亚乳杆菌L.b- 1.1480 MRS优化培养基的主要营养组分为蔗糖、蛋白胨和ZnSO4，添加量分别为0.6%蔗糖，0.4%蛋白胨和0.08%ZnSO4。同时考察了增殖因子对保加利亚乳杆菌生长的影响，影响菌液活菌数的主要因素主次顺序为A＞C＞B＞D，即番茄汁、绿豆芽汁、平菇汁和啤酒的添加量，L.b- 1.1480最佳增殖因子为7.5%番茄汁、2.5%平菇汁、1.0%绿豆芽汁和4.0%啤酒。同时，测定其最佳培养时间分别为16 h，保加利亚乳杆菌活菌数达到7.82×108CFU/mL，是基础培养基的6.74倍，培养液的终点pH值为4.03，基本达到了保加利亚乳杆菌高密度培养的要求，为保加利亚乳杆菌产品的进一步开发提供了理论和实践依据。

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Research on the Enhance of Lactobacillus bulgaricus Enrichment Culture Medium

WANG Yuenan
（School of Chemistry and Life Science，Anshan Normal University，Anshan，Liaoning 114007，China）

Abstract：Studies on the growth of Lactobacillus bulgaricus cultured in improving MRS and enrichment culture medium. Furthermore，the optimum enrichment medium of L.b- 1.1480 are screened by orthogonality test. The results show when adding fructose 0.6%，peptone 0.4%，ZnSO40.08%，the cell density of L.b- 1.1480 is 4.05×108CFU/mL. When adding tomato juice 7.5%，mushroom juice 2.5%，mungbean sprout juice 1.0%，beer 4.0%in improving MRS，the cell density of L.b- 1. 1480 is 6.74 times increased from 1.16×108CFU/mL to 7.82×108CFU/mL，and the destination pH is 4.03.

Key words：Lactobacillus bulgaricus；growth- stimulated substance；enrichment culture medium

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.003

文章编号：1671- 9646（2016）05a- 0007- 04

收稿日期：2016- 04- 22

作者简介：王月囡（1981—），女，硕士，助教，研究方向为食品科学与食品生物技术。