以基因芯片探究针刺泻法对应激性高血压前期大鼠肾脏基因表达的影响

纪　智，郭　文，朱华超，谢晓佳，孙启胜，刘清国

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)

以基因芯片探究针刺泻法对应激性高血压前期大鼠肾脏基因表达的影响

纪智，郭文，朱华超，谢晓佳，孙启胜，刘清国*

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029)

摘要：目的运用基因芯片技术检测针刺泻法对应激性高血压前期大鼠肾脏基因表达的影响并分析其内在机理。方法雄性Wistar大鼠27只，随机分为空白组、模型组、模型+针刺泻法组，每组9只。造模方法：噪声结合足底电击刺激，周期为14 d。造模同时针刺泻法组取曲池穴、太冲穴进行干预，模型组和空白组每天做与针刺组相同的抓取刺激。在造模前1天、第3、5、7、9、11、13、15天测量大鼠的血压，并观察其生理学行为学改变。第15天量取血压后取材，用Rat Gene 2.0 Array technology进行基因芯片分析。结果造模期间空白组血压始终保持正常水平。模型组在造模第3天即突破了120 mmHg(P<0.01)，并在后来的第5、7、9、11、13、15天持续升高至较高水平(P<0.01)。造模过程中大鼠出现尖叫、咬架、小便变黄、毛质粗糙、眼睛充血等变化，且血压始终处于120～139 mmHg范围内，说明造模成功。模型+针刺泻法组的血压值在第5、7、9、11、13、15天均明显低于模型组。基因表达频谱结果显示：与模型组相比，模型+针刺泻法组有106个基因表达升高，92个基因表达降低。其中高血压相关基因CYP1A1、IGFBP-1的表达也发生相应变化。结论针刺太冲、曲池并施以泻法，可明显降低应激性高血压前期大鼠的血压，并影响其肾脏的基因表达。

关键词：针灸疗法；泻法；应激性高血压前期；基因芯片

应激性高血压[ 1]的发病机理复杂，其内在机制主要包含下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴(HPA)[2 ]，肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAS)[3 ]，交感神经—肾上腺髓质系统(SAM)[4 ]。美国JNC7中提出“高血压前期”(120～139/80～89 mmHg)的概念，旨在引起医务人员和公众对于高血压前期这一特殊阶段的重视[5 ]。因为这一人群的基数大，进展至高血压的比例高，罹患冠心病、脑卒中与终末期肾病的概率大，并已经出现了靶器官的损伤和相应基因和蛋白的表达的改变[6 ]。研究[7-8 ]表明，针刺治疗对血压的降低作用，主要通过调节神经系统、免疫系统和血管内皮细胞实现。而在本课题组既往多项实验结果[ 9-10 ]中发现，针刺泻法降血压的效果最佳，明显高于针刺补法组和静留针组。

基因芯片技术是目前发展迅速的一项生物技术，用于检测和分析基因表达。具有高通量、高灵敏性、高效率的特点，可同时监测多个基因。这样的特点为分析研究受高血压影响的多个基因提供了可能[11 ]。之前的研究着重于中后期高血压的治疗和对靶器官的保护，少有对于高血压前期基因表达和干预的研究。本研究将探查针刺泻法对应激性高血压前期的调控作用，并应用基因芯片技术监测重点基因，从基因层面系统地阐释其作用机理，从而为针刺预防和治疗高血压提供新的思路。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组选用健康成年SPF级Wistar大鼠27只，雄性，体质量(220±30)g。由北京维通利华实验动物中心提供。饲养环境舒适清洁，通风良好，定期紫外线消毒。室温控制在(20±1)℃，湿度50%，光线模拟自然环境的12 h昼夜交替。自由进食及饮水，每日清扫粪便，更换垫料。采用完全随机设计法，利用随机数字表将Wistar大鼠分为空白组、模型组、模型+针刺泻法3组，每组9只。

1.2动物模型制备本实验采用目前最通行的，电击足底结合噪声刺激的方式，制备应激性高血压大鼠模型。模型组和模型+针刺泻法组大鼠，每天上午8∶00-10∶00 、下午2∶00-4∶00 各接受1 次电击足底结合噪声应激刺激。应激时将动物放在(22 cm×22 cm×26 cm) 笼内，笼子底部由细的铜栅构成，通过铜栅给动物足底电脉冲刺激，刺激脉冲每2～25 s之间随机发生1次，刺激脉冲电压为80 V，持续时间50 ms/次，电刺激时由蜂鸣器发出噪声(80～100 db，时程50 ms)。1.3干预方式将各组大鼠舒适的固定于特质鼠套中，露出四肢，固定20 min。针刺泻法组取太冲穴(双侧)、曲池(双侧)，取穴参照《实验针灸学》教材：于后肢足背1、2趾骨凹陷处取太冲穴，直刺1 mm；于桡骨近端，肘关节外侧前方凹陷中取曲池穴，直刺4 mm。采用中研太和牌一次性25号0.5寸毫针(无锡佳健医疗器械有限公司生产)。以右手为刺手,太冲穴大拇指作用力向后时用力捻转，然后轻力向前退回，捻转幅度360°/次，60次/min，持续捻转1 min，10 min后再行针1次，共留针20 min。空白组和模型组进行与针刺泻法组相同的捉抓刺激。干预方式，1次/d，由同一人员操作，保持相同干预方式14 d直至取材。

1.4取材方法及观测指标实验第15天量取大鼠尾动脉血压后，将其麻醉后断头处死，立即置于冰盘中剪取双肾，用液氮快速冷冻固定后存放在-80 ℃冷冻室内。于造模结束2 h后测量大鼠尾动脉收缩压，测试环境保持(22±2) ℃恒温。大鼠在36 ℃环境中预热15 min，用无创血压仪在大鼠安静清醒的状态下测取血压值。每只大鼠测量3次，取平均值。实验开始前1天测量1次，实验第3、5、7、9、11、13、15 天各测量1次。应用mirVana miRNA isolation Kit技术从27只大鼠中分别提取RNA。每组样本应用Gene Chip Rat GENE 2.0 ST Array 进行基因表达频谱分析，并重复3次。应用Affymetrix protocol对每组样本进行标记和芯片杂交。应用Affymetrix Gene Chip 645系统进行芯片杂交，随即应用Affymetrix Gene Chip 450系统进行洗染。最后应用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner 进行扫描。

1.5数据分析将扫描后的CEL格式图像输入到Affymetrix Expression console software，对基因芯片图像进行数据分析。使用Robust Multichip Average 算法对基因表达数据进行归一化处理和分析。而后将归一化后得到的CHP格式的数据，输入Transcriptome Analysis console中进行下一步分析。通过比较3组之间基因表达差异，通过fold-change值观察基因上调或下调的变化趋势,其中fold-change值≥1.5的为差异基因。筛选出两样本之间差异表达基因之后，通过超几何检验的方法，进行差异表达基因的Go功能富集分析。

2结果

2.1各组大鼠收缩压变化15 d中，空白组大鼠的收缩压一直处于正常水平。相比之下模型组在造模第3天即突破120 mmHg(P<0.01)，并在后来的第5、7、9、11、13、15天持续升高至较高水平(P<0.01)。模型+针刺泻法组的血压值上升相对平缓，在第5、7、9、11、13、15天均明显低于模型组。说明太冲、曲池穴施以针刺泻法，可有效抑制应激性前期高血压大鼠血压升高。

2.2各组大鼠基因表达变化基因表达频谱结果fold change值显示，与空白组比较，模型组有187个基因表达发生了变化。其中有99个基因表达升高，88个基因表达降低。与模型组相比，针刺泻法干预改变了198个基因的表达，其中有106个基因表达升高，92个基因表达降低(P<0.05，fold change≥1.5)。基因表达频谱结果显示，有43个基因表达在模型组中升高，在模型+电针组降低；另有34个基因表达在模型组中降低，在模型+电针组中升高。

2.3Go功能富集分析本实验还进行了Go功能富集分析来探查在针刺泻法的干预下，表达发生改变的基因所相关的生理功能，结果如图1所示，包含生理功能和细胞组分。最终得出与差异基因相关的功能条目为chemical，stress，stimulus，biotic stimulus，protein folding，external biotic stimulus，extracellular region part，unfolded protein binding，endoplasmic reticulum lumen，external stimulus(富集分值最高的10个，enrichment值≥10)等。

图1　Go功能富集分析结果

3讨论

原发性高血压中应激性高血压所占比率高达22.2%，而焦虑、紧张等情绪是造成应激性高血压的主要原因[12 ]。本实验所采用的电击足底结合噪声刺激的方式，为身体和心理的多重刺激，类似人类生活的多应激源环境，是目前最成熟和通用的应激性高血压模型制作方式。实验中与空白组相比，模型组大鼠血压有大幅度升高，且出现跳起、尖叫、咬架、大便硬、小便黄、毛发粗糙、眼睛充血等变化，符合人类高血压中肝阳上亢的证候表现。这说明本次实验造模成功，也验证了长期身心压力可导致血压升高的理论。

本实验模型处于高血压前期，气阴亏耗尚轻，属肝阳上亢的实证，故针刺采用泻法最为适宜。而根据前期课题研究结果表明，泻法组降压效果明显优于补法组和静留针组。在本次实验过程中,第5天开始针刺泻法组的血压相比模型组有明显下降，与笔者的前期研究结果一致。曲池、太冲2穴为临床高血压治疗常用穴，其降压效果已经大量实验研究证实。曲池穴是手阳明大肠经合穴，“合主逆气而泄”,且大肠经属金能克肝木，故针刺曲池穴有平肝泻火的作用。太冲穴为肝之原穴，为“一身气化发生之始”“握升降之枢”。具疏肝行气之功，是治疗高血压病的要穴。曲池、太冲配伍，一脏一腑、一阴一阳，共奏调气降逆、平肝潜阳、柔肝熄风之功。

高血压的发病与多个基因相关，并受到多方面环境的影响。因此，通过检测所有相关基因的表达并分析组间差异的方法，可较系统的分析高血压的调控机制。本研究基因芯片结果表明模型组与空白组之间，针刺泻法+模型组与模型组之间的基因表达，均存在明显的差异。其中一些基因表达的差异已被证实与高血压相关。

CYP1A1是CYP基因家族的一员，负责合成细胞色素P450酶[13 ]。IGFBP-1是胰岛素生长因子结合蛋白基因家族中的一员，负责合成胰岛素生长因子结合蛋白1[14 ]。IGFBP-1蛋白在血浆中循环，并结合胰岛素样生长因子IGF-1，IGF-1与IGFBP-1结合后，其半衰期得以延长,与细胞表面受体的相互作用也发生改变。研究[15 ]表明IGF-1是一种心血管疾病的保护因子,可通过诱导一氧化氮(NO)的合成，从而产生舒张血管的功能。高血压患者血清IGF-1浓度升高，并随着血压水平和病情严重程度更加明显[16 ]。基因芯片结果表明，CYP1A1、IGFBP-1基因可能是应激性高血压前期的靶基因之一，而针刺泻法可以抑制CYP1A1、IGFBP-1基因的表达。针刺泻法可能通过干预CYP1A1、IGFBP-1基因的表达，起到降压效果，其具体机理尚待进一步研究。

本实验结果表明，针刺太冲、曲池并施以捻转泻法，可明显降低应激性高血压前期大鼠血压值，并影响其肾脏的基因表达。

参考文献：

[1]刘力生.中国高血压防治指南2010[J].中华高血压杂志,2011,18(8):701-743.

[2]OLIVEIRA B F,NOGUEIRA-MACHADO J A,CHAVES M M.The role of oxidative stress in the aging process[J].Scientific World Journal,2010,5(10):1121-1128.

[3]NARITA K,MURATA T,HAMADA T,et al.Interactions among higher trait anxiety,sympathetic activity,and endothelial function in the elderly[J].J Psychiatr Res,2007,41(5):418-427.

[4]ALZAYADNEH E M,CHAPPELL M C.Angiotensin-(1-7) abolishes AGE-Induced cellular hypertrophy and myofibroblast transformation via inhibition of ERK1/2[J].Cell Signal,2014,26(12):3027-3035.

[5]CHOBANIAN A V,BAJAKRIS G L,BLACK H R,et al.The Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention,Detection,Evaluation,and Treatment of High Blood Pressure:the JNC 7 report[J].JAMA,2003(19):2560-2572.

[6]黄裕立.高血压前期和心脑肾血管风险相关性的研究[D].广州:南方医科大学,2014.

[7]FLACHSKAMPF FA,GALLASCH J,GEFELLER O,et al.Randomized trial of acupuncture to lower blood pressure[J].Circulation,2007,115:3121-3123.

[8]PARK J M.The acute effect of acupuncture on endothelial dysfunction in patients with hypertension:a pilot,randomized,double-blind,placebo-controlled crossover trial[J].The journal of alternative and complementary medicine,2010,16(8):883-888.

[9]安娜.“平冲降逆育阴”针刺法对原发性高血压即刻降压效应的临床观察[D].北京:北京中医药大学,2013.

[10]陈中.太冲穴针刺捻转泻法对原发性高血压即刻效应影响的临床研究[D].北京:北京中医药大学,2013.

[11]Y.C.WU,G.R.ZHAO,Y.Z.DU.Progressofclinicalresearch on acupuncture moxibustion treatment of liver yang hyperactivity type hypertension[J].Heilongjiang Journal of Traditional Chinese Medicine,2008(6):30-31.

[12]RUTLEDGE T,HOGAN B E.A quantitative review of prospective evidence linking psychological factors with hypertension development [J].Psychosom Med,2002,64(5):758-766.

[13]PARK H Y.Interaction effect of serum 25-hydroxyvitamin D levels and CYP1A1,CYP1B1 polymorphisms on blood pressure in an elderly population[J].J Hypertens,2015,33(1):69-76.

[14]HEALD A.H.,SIDDALS K.W.,FRASER W.,et al.Low circulating levels of insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) are closely associated with the presence of macrovascular disease and hypertension in type 2 diabetes[J].Diabetes,2002,51:2629-2636.

[15]CONTI E,CARROZZA C,CAPOLUONGO E,et al.Insulin-like growth factor-l as a vascular Protective factor Circulation[J].Basic science for clinicians,2004,110:2260-2265.

[16]左奇玉.胰岛素样生长因子-1和原发性高血压的关系[J].岭南心血管病杂志,2011,17(5):390-392.

Twirling-reducing needling manipulation on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rats

JI Zhi,GUO Wen,ZHU Huachao,XIE Xiaojia,SUN Qisheng,LIU Qingguo*

(School of Acupuncture,Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of twirling-reducing needling manipulation(TRNM) on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rat by gene chip technology.MethodsTwenty-seven,male Wistar rats were randomly divided into 3 groups (n=9/group):blank control group,model control group and model+TRNM group.Foot-shocks combined with generated noise was applied in the preparation of stress-induced pre-hypertension model and lasted for 14 days.Twirling-reducing needling manipulation was used on Taichong(LR3) and Quchi(LI11) of TRNM group along the molding cycle.The model control and blank control group rats were grabbed in the same restrainers for 20min without any other intervene.Systolic blood pressure(SBP) was tested one day before work and on the 3 rd,5 th,7 th,9 th,11 th,13 th and 15 th day.Gene expression profiles was determined by Rat Gene 2.0 Array technology.ResultsSBP of blank control group rats stayed normal along the modeling cycle.At the 3rd day,SPB of model control group elevated to 120 mmHg(P<0.01),and continuously rose to 139 mmHg,along with changes like irritation,squealing,yellow urination and bloodshot eyes,which indicates the success of modeling.SBP of TRNM group was significantly lower (P<0.01) than model control group since the 5 th day.Microarray analysis showed that compared with model control group,106 genes were upregulated and 92 genes were downregulated in TRNM group.The expression of CYP1A1 and IGFBP-1,which have a close relationship with hypertension and organ damage,was significantly changed by Twirling-reducing needling.ConclusionTwirling-reducing needling manipulation at Taichong and Quchi can significantly lower the SBP of stress﹣induced pre-hypertension rats and effect its gene expression in kidney.

Keywords：acupuncture;twirling-reducing needling manipulation;stress-induced pre-hypertension;gene chip

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.007

基金项目：国家自然科学基金“基于系统生物学的针刺对应激性前期高血压的调控机制与干预靶点的研究”(81373727)。

作者简介：纪智(1990-)，男，硕士研究生，主要从事针灸临床及机理研究。

*通信作者：刘清国，男，教授，电话-13691517881，电子信箱-liuqingguo999@vip.sina.cn

中图分类号：R245.3

文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2016)03-0458-04

(收稿日期:2015-11-19)