黄芪多糖对阿尔茨海默病大鼠海马超微结构和低密度脂蛋白受体相关蛋白1水平的影响

姜　波，费洪新，宋　磊，尹丽颖，仲丽丽，张英博，李宝龙，周忠光*

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

·实验研究·

黄芪多糖对阿尔茨海默病大鼠海马超微结构和低密度脂蛋白受体相关蛋白1水平的影响

姜波1，费洪新2，宋磊1，尹丽颖1，仲丽丽1，张英博2，李宝龙1，周忠光1*

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

摘要：目的探讨黄芪多糖(APS)对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马超微结构和低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP1)水平的影响。方法Wistar大鼠随机分成对照组，模型组，治疗组(吡拉西坦0.5 g/kg)，APS高、中、低剂量组(APS 0.8、0.4、0.2 g/kg)。采用Aβ1-42双侧脑室注射大鼠诱导建立AD模型。给予APS连续灌胃治疗30 d后取材，观察大鼠海马镜下超微结构、计算脾和胸腺脏器指数。采用酶联免疫吸附法检测海马Aβ1-40和LRP1，血清Aβ1-40水平。采用RT-PCR法检测海马LRP1 mRNA的含量。结果与模型组比较，APS高、中剂量组脑海马形态明显改善，脾和胸腺脏器指数明显增加(P<0.05)，海马组织Aβ1-40水平明显降低(P<0.05)，海马组织LRP1和血清Aβ1-40水平明显增加(P<0.05)。结论APS能改善AD大鼠海马形态结构，增加海马LRP1水平、脾和胸腺脏器指数。

关键词：黄芪多糖；阿尔茨海默病；超微结构;LRP1

阿尔茨海默病(AD)是临床上常见的高发于老年人的疾病之一[1]，AD主要病理是β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成老年斑(SP)，Aβ主要包括Aβ1-42和Aβ1-40，其中Aβ1-40促进Aβ1-42沉积，利于SP的形成[2]。黄芪多糖(APS)是黄芪的主要成分之一，APS的临床应用十分广泛，如APS促进糖尿病大鼠模型皮肤伤口愈合[3]，APS治疗糖尿病综合效果较好[4]，APS减轻氧化损伤和抑制细胞凋亡[5]，APS通过核转录因子-κB途径发挥抗氧化作用[6]，APS提高西药顺铂的抗肿瘤效果[7]，APS通过抑制转化生长因子β(TGF-β)来治疗全身性硬皮病等[8]。本课题的前期工作显示，APS可以改善AD小鼠学习记忆能力[9]。实验制备AD模型方法包括海马注射Aβ1-42[10-12]、海马注射Aβ1-42及腹腔注射D-半乳糖[13]、APP/PS1双转基因小鼠模型[14-16]等。基于APS对Aβ1-42诱导AD大鼠的研究国内外尚无文献报道，因此本实验采用APS为处理因素，以Aβ1-42诱导AD大鼠模型为研究对象，观察APS对AD大鼠超微结构、脏器指数和LRP1的影响。

1实验材料

1.1实验动物清洁级雄性Wistar大鼠36只，体质量(230±20) g[由黑龙江中医药大学实验动物中心李宝龙副主任提供，质量合格证书号码：SCXK(黑)2013-012]。Wistar大鼠饲养在常温、常湿的屏障动物实验设施环境中，动物自由摄取无菌食物和水。

1.2药品和试剂LRP1和Aβ1-40酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140401)，Aβ1-42(Sigma公司)，吡拉西坦(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：5140556)，APS(南京泽朗医药科技集团公司)，其他试剂均为国产分析纯，由黑龙江中医药大学中医药研究院周忠光教授提供。

1.3仪器Applied Biosystems step one plus定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，TCNAI-G2型透射电子显微镜(荷兰公司)，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，PLZOZ-S型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，STW-1型脑立体定位仪(成都仪器厂)，6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)等。

2实验方法

2.1复制AD模型大鼠水合氯醛进行麻醉后，剪去头顶部毛发，暴露顶骨，STW-1型脑立体定位仪定位大鼠海马区，双侧脑室海马区一次性注入10 μg凝聚态Aβ1-42(2 μg/μL)，针头留下15 min，包扎大鼠头部，预防感染；同时对照组大鼠双侧脑室注射等量生理盐水。

2.2分组实验大鼠按照随机数字表的排列顺序，随机将大鼠分为对照组，模型组，治疗组，APS高、中、低剂量组，每组6只，共36只。

2.3给药对照组和模型组大鼠给予生理盐水灌胃，治疗组给予吡拉西坦0.5 g/kg灌胃、APS高剂量组给予APS 0.8 g/kg灌胃、APS中剂量组给予APS 0.4 g/kg灌胃、APS低剂量组给予APS 0.2 g/kg灌胃，灌胃持续时间30 d。

2.4透射电子显微镜观察海马CA1区结构实验大鼠末次给药2 h后，麻醉，剪开胸腔，暴露心脏，针头插入左心室，左心室缓慢灌注150 mL生理盐水，密切观察肝脏，直到肝脏变白后,然后用2.5%戊二醛灌注，取材大鼠脑组织海马CA1部位、2.5%戊二醛固定、四氧化锇固定、脱水、包埋、切片等过程,TCNAI-G2型透射电子显微镜观察大鼠脑组织海马CA1区结构。

2.5测定脾和胸腺脏器指数大鼠断头处死后，冰台上迅速解剖，取材大鼠脾和胸腺，用生理盐水清洗干净，电子天平精确称取大鼠脾和胸腺的脏器质量，计算脏器指数。

2.6检测海马Aβ1-40、海马LRP1和血清Aβ1-40大鼠眼球摘除，取混合血，然后大鼠断头迅速取海马组织，匀浆，4 ℃静置血液和海马匀浆液1 h，TGL-16G台式离心机4 000 r/min离心30 min，分装，-80 ℃冰箱保存备用。按说明书进行操作，使用6100型RT-雷杜酶标仪，450 nm波长处测定各孔吸光度(A)。根据标准曲线方程求出海马Aβ1-40、海马LRP1和血清Aβ1-40。

2.7Real-time-PCR法测定海马LRP1 mRNA表达大鼠末次给药2 h后，麻醉大鼠后处死，冰台上迅速取大鼠海马。按照试剂盒说明书，应用Trizol试剂盒提取海马总RNA，逆转录合成c DNA，进行PCR扩增。设计LRP1引物：上游引物：5’- CCG ACT GGC GAA CAA ATA CAC-3’，下游引物 :5’- ATC GGC TTT GTT GCA CGT G-3’；β-action引物：上游引物:5’- CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA -3’，下游引物：5’- AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3’。引物由中国上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体系参数：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。扩增产物以2-ΔΔCt法表示LRP1 mRNA相对表达量。

3结果

3.1APS对AD大鼠脑海马CA1区超微结构的影响对照组大鼠海马CA1区神经元细胞质比较丰富，可以见到神经元双层核膜，内外层核膜较清晰，粗面内质网丰富；模型组大鼠海马CA1区神经元细胞质较少，细胞器不丰富，神经元内外层核膜不清楚，粗面内质网较少；治疗组、APS高剂量组、APS中剂量组和APS低剂量组大鼠海马CA1区神经元细胞质内的细胞器不同程度地增加，细胞器比较丰富，核膜较清晰。

3.2APS对AD大鼠脾指数和胸腺指数的影响见表1。

表1　APS对AD大鼠脾指数和胸腺指数的影响

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

3.3APS对AD大鼠海马Aβ1-40和血清Aβ1-40的影响见表2。

组 别剂量/(g/kg)海马Aβ1-40/(ng/L)血清Aβ1-40/(ng/L)对照组 —194.63±58.39 163.86±44.19 模型组 —328.24±54.49#95.41±32.27#治疗组 0.5216.08±53.67△156.40±49.13△APS高剂量组0.8220.65±65.89△149.79±42.98△APS中剂量组0.4229.78±53.33△144.14±37.36△APS低剂量组0.2292.93±52.19 101.73±25.93

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

3.4 APS对AD大鼠海马LRP1的影响见表3。

表3　APS对AD大鼠海马LRP1的影响

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

3.5APS对AD大鼠海马LRP1 mRNA含量的影响见表4。

表4　APS对AD大鼠海马LRP1 mRNA含量的影响

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

4讨论

AD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病之一，其病变区域主要集中在海马、皮质等[17]，而海马的CA1区与AD关系密切，因此主要观察海马CA1区超微结构变化。经过APS治疗后，APS组大鼠海马CA1区神经元形态较为规则，细胞质内的细胞器增加，说明海马神经元的结构得到不同程度地恢复。

本实验结束后测定各组大鼠脾指数和胸腺指数，模型组的大鼠脾指数和胸腺指数降低，提示模型组大鼠脾和胸腺相对质量减轻，预示模型组免疫功能降低。经过APS治疗后，APS高、中剂量组脾指数和胸腺指数升高，说明APS可以增加脾和胸腺相对质量，增加机体的免疫功能。

AD脑内Aβ1-40可通过BBB进行转运进入血液中，Aβ1-40参与影响脑组织和血液的Aβ1-40库。实验结果中，模型组小鼠海马Aβ1-40增加，可促进脑组织Aβ1-42成熟，加速脑组织形成SP，同时血清Aβ1-40降低，提示血清Aβ1-40通过BBB进入脑，进一步增加脑Aβ,从而加重AD进程。经过APS治疗后，APS高、中剂量可将海马Aβ1-40跨BBB转运到脑外，减少脑组织Aβ1-40，以此治疗AD。

为了探寻海马Aβ1-40与血清Aβ1-40的关系，实验通过酶联免疫及其RT-PCR方法检测了与Aβ1-40转运密切相关的LRP1，LRP1促进Aβ转运出脑。本实验结果表明APS高、中剂量可增加海马LRP1表达来下调海马Aβ1-40，改善AD海马CA1区的超微结构。

综上所述，APS可改善AD大鼠海马CA1区超微结构，增强AD大鼠免疫功能，APS防治AD的机制与降低海马LRP1表达有关。

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Astragalus polysaccharides on ultrastructure and lipoprotein receptor-related protein 1 of hippocampus in Alzheimer's disease rat

JIANG Bo1,FEI Hongxin2,SONG Lei1,YIN Liying1,ZHONG Lili1,ZHANG Yingbo2,LI Baolong1,ZHOU Zhongguang1*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China；2.Qiqihar Medical University,Qiqihaer 161006,Heilongjiang Province,China)

Abstract：ObjectiveEffects of astragalus polysaccharides (APS) on ultrastructure and lipoprotein receptor-related protein 1(LRP1) of hippocampus in Alzheimer's disease (AD) rat.MethodsWistar rat were randomly divided into control group,model group,treatment group (Piracetam 0.5g/kg),APS high-dose group(APS 0.8 g/kg),APS medium-dose group (APS 0.4 g/kg),APS low-dose group (APS 0.2 g/kg).Aβ1-42was injected into the bilateral hippocampus of rat to induce AD models.The rat were killed after 30 days continuous treating.After the treatment all animals were sacrificed,ultrastructure of hippocampus was observed,calculated the organ coefficients of splenic and thymus.The levels of Aβ1-40and LRP1 in the hippocampus were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The levels of Aβ1-40in the serum were measured by ELISA.The content of LRP1 mRNA in the hippocampus was determined by reverse-transcription PCR (RT-PCR).ResultsCompared with the model group,the APS high-dose group and APS medial-dose group brain maintain normal morphological structure of hippocampus was significantly increased,the organ coefficients of splenic and thymus significantly increased (P<0.05),the levels of Aβ1-40in the hippocampus were significantly decreased (P<0.05),the levels of LRP1 in the hippocampus and the levels of Aβ1-40in the serum were significantly increased (P<0.05).Conclusion APS can maintain normal morphological structure of hippocampus of AD rat,increased LRP1 responses in the hippocampus tissue,organ coefficients of splenic and thymus.

Keywords：Astragalus polysaccharides;Alzheimer's disease;ultrastructure;LRP1

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.005

基金项目：国家自然科学基金(81373777，81173599);高校博士学科点科研基金 (博导类：20132327110010);黑龙江中医药大学博士后基金(LBH-Z14196);黑龙江省青年基金(QC2015101)。

作者简介：姜波(1979-)，女，博士，副研究员，硕士研究生导师，主要从事老年病及中药新药研究。

*通信作者：周忠光，博士，教授，博士研究生导师，电话-13514641639，电子信箱-feihongxin2008@163.com

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2016)03-0451-04

(收稿日期:2015-11-11)