化毒补虚方含药血清对人肺腺癌细胞增殖及凋亡的实验研究*

陕西中医药大学

全建峰　王英英　白小娜　王郁金(咸阳 712000)

实 验 研 究

化毒补虚方含药血清对人肺腺癌细胞增殖及凋亡的实验研究*

陕西中医药大学

全建峰王英英白小娜王郁金(咸阳 712000)

提要目的：观察不同浓度、不同时间化毒补虚方诱导肺腺癌细胞A549的抑制增殖作用及促进凋亡作用。方法：应用四氮唑蓝比色法( MTT法)检测化毒补虚方对人肺腺癌细胞增殖的影响，同时筛选出起有效抑制作用的浓度；并应用倒置显微镜观察细胞形态的变化及荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)观察细胞超微结构的变化。结果：MTT实验显示化毒补虚方抑制肺腺癌细胞增殖，其中50%浓度含药血清组对A549细胞抑制作用明显，在48 h达作用高峰；观察细胞形态及超微结构发现A549细胞形态发生明显改变，并可见凋亡小体。结论：化毒补虚方通过杀伤肺腺癌细胞、诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。

关键词化毒补虚方；人肺腺癌细胞；肺腺癌；增殖及凋亡；实验研究；四氮唑蓝比色法

肺癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率呈现上升趋势，非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的常见类型，约占80%，其中最常见的是肺腺癌，在目前的肺腺癌临床治疗中，西医常用手术、放化疗和分子靶向治疗等方法；虽然取得了很大发展，但各有其治疗的局限性，比如不具备手术适应症，化疗耐药及出现无法耐受的毒副作用。中医药已经证明对于肺癌治疗的有效性，其对于调整肌体整体平衡，改善放、化疗治疗的毒副反应，提高生存时间和生存质量具有重要意义。[1]结合多位中医专家的医疗经验所立的主方“化毒补虚方”，在大量NSCLC的中医治疗中取得了较好疗效，因其符合攻邪化毒与补虚扶正并重，依据病情变化调整的思想。本实验就化毒补虚方为主要研究对象，采用四氮唑蓝比色(MTT)法[1]观察其对人肺腺癌细胞的体外生长抑制作用，并用倒置显微镜及荧光显微镜等观察细胞形态及超微结构的变化，进一步了解化毒补虚方对肺腺癌生长的抑制作用及可能机制。

1实验材料

1.1细胞株及实验用大鼠A549(人肺腺癌细胞株)由第四军医大学西京医院肿瘤实验中心提供，Wistar大鼠购于南京君科生物工程有限公司。

1.2样品、试剂及仪器

1.2.1样品：化毒补虚方汤剂(组成：半夏、全蝎、地龙、灵芝、山慈菇、半枝莲、绞股蓝、甘草等)，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”将汤剂浓缩成2.25 g/mL，用于大鼠灌胃给药。

1.2.2主要试剂与仪器：RPMI-1640培养基，胎牛血清，MTT,无菌操作台，CO2培养箱，低温高速离心机，倒置相差显微镜，荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)，96孔板，酶标板自动读数仪等。

2实验方法

2.1含药血清制备对标准购置的Wistar大鼠灌胃，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”将汤剂浓缩成2.25 g/mL，即大鼠灌胃剂量为4.45 g/kg。每天给药1次，连续7天，末次给药后在无菌条件下经腹主动脉取血，室温静置后取上清，3 000 r，30 min离心，取上清，即为含药血清，经56℃水浴灭活后，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，经培养证明无微生物污染后，置-20℃保存备用。

2.2细胞培养将购自第四军医大学西京医院肿瘤实验中心的人肺癌A549细胞进行原代培养，于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁，待细胞贴壁(约6 h后)，换培养液1次，至细胞长成单层后(约3 d左右)进行传代。用细胞计数板在显微镜下计数，分装新培养瓶中，置于37℃、饱和湿度含5%CO2的细胞培养箱中无菌培养。

2.3体外抗肿瘤活性测定

2.3.1四氮唑蓝比色法( MTT法)：将对数期生长的A549肺腺癌细胞接种于96孔板中，实验组加入不同浓度(100%、50%、33%、25%、20%浓度)的含药血清，对照组加入含胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24、48、72 h的肺腺癌A549细胞的生长抑制率。

细胞生长抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%

2.3.2倒置显微镜及荧光显微镜、TEM观察细胞形态及超微结构：观察对肺腺癌细胞生长抑制最明显浓度的细胞细胞形态的变化及细胞超微结构的变化，观察是否出现凋亡小体、核染色质固缩、边集等现象。

2.4统计分析应用统计软件SPSS13.0对试验数据进行统计分析，P<0.05为差异有显著性。

3实验结果

3.1MTT法检测化毒补虚方对A549细胞增殖的影响观察100%、50%、33%、25%、20%浓度的含药血清作用24、48、72 h后A549细胞的吸光值，25%浓度的含药血清组的吸光值差异无显著性，而100%、50%、33%、20%浓度的含药血清组及对照血清组的吸光值差异有显著性。结果见表1。而50%浓度含药血清组对A549细胞抑制作用明显，在48 h作用达高峰，不排除随着时间延长，含药血清浓度降低，而降低含药血清的抑制作用。结果见图1。

表1含药血清不同作用时间对A549细胞的影响

分组24h吸光值抑制率(%)48h吸光值抑制率(%)72h吸光值抑制率(%)20%血清组0.060±0.00814.70.141±0.01833.40.225±0.03321.025%血清组0.064±0.0158.90.214±0.065-9.4 0.197±0.00714.333%血清组0.059±0.00916.50.237±0.010-11.0 0.226±0.0111.750%血清组0.036±0.01749.20.107±0.01350.00.236±0.010-2.6 100%血清组0.049±0.00730.70.125±0.01841.50.206±0.01110.4对照血清组0.070±0.0100.0*0.212±0.0250.0*0.230±0.0110.0*

M：与实验组相比，*P<0.05

M：含药血清浓度1、2、3、4、5分别为20%、25%、33%、50%、100%浓度含药血清。

图1含药血清对人肺癌细胞株A549抑制率

3.2实验组与对照组细胞形态学及超微结构观察通过倒置显微镜及Hoechst荧染色法对A549细胞形态观察，发现A549细胞形态发生明显改变，并可见凋亡小体，说明含药血清可能诱导A549的凋亡。分析：⑴倒置显微镜观察：50%浓度含药血清组细胞变小变圆，皱缩，可见部分脱落细胞，胞浆透光度减小，颗粒感增强(图2)；对照血清组的A549细胞呈单层贴壁生长，生长舒展，无脱落，胞浆丰满，透亮，大多呈梭形(图3)。⑵Hoechst染色后在荧光显微镜下观察：50%浓度含药血清组细胞核大小不一，形态不规则，可见较多核凝集致密浓染，荧光增强，核固缩碎裂呈颗粒状荧光，偶见凋亡碎片(图4、图5)；对照血清组A549细胞大小较一致，细胞壁完整，形态正常，细胞核呈圆形或椭圆形，核内染色质呈均匀蓝色荧光(图6)。

图250%浓度含药血清组

A549细胞变小变圆，皱缩，可见部分脱落细胞，胞浆透光度减小，颗粒感增强。(倒置显微镜 200×视野)

图3对照血清组

A549无脱落，胞浆丰满，透亮，大多呈梭形。(倒置显微镜200×视野)

图450%浓度含药血清组

形态不规则，可见较多核凝集致密浓染，荧光增强，核固缩碎裂呈颗粒状荧光(Hoechst 400×视野)

图550%浓度含药血清组

形态不规则，核凝集致密浓染，荧光增强，可见凋亡碎片(Hoechst 400×视野)

图6对照血清组

大小较一致，细胞壁完整，形态正常，细胞核呈圆形或椭圆形，核内染色质呈均匀蓝色荧光(Hoechst 400×视野)

4讨论

近年来，中医药在肿瘤防治中以其确切的疗效备受人们关注，具有较好的临床疗效及应用前景，自拟“化毒补虚”方是结合了多位中医临床肿瘤专家临证使用经验后所拟，其中半夏为肺癌治疗的常用药，半夏主要用于燥湿、化痰、止咳、抗炎、抗肿瘤作用。半夏提取物以及半夏化学成分中的半夏蛋白、半夏总生物碱、谷甾醇、半夏多糖等都具有抗肿瘤的作用。李娟等[2]对半夏类药材提取物体外抗肿瘤的活性的研究中发现其抗肿瘤作用与抑制S期细胞增殖和激活Caspase家族诱导细胞凋亡有很大的关系，其中诱导细胞凋亡是半夏类抗肿瘤的作用机制之一。半夏蛋白中30%硫酸铵沉淀部分对 Bel-7402 细胞生长具有明显抑制作用及促进 Bel-7402 细胞凋亡的作用。[3]掌叶半夏总蛋白对体外培养的卵巢癌细胞SKOV3的生长有明显的抑制及促凋亡作用。[4]而400、200、100 μg/mL的半夏生物碱对肝癌细胞Bel-7402有明显的抑制作用，且随着半夏生物碱浓度的增加，抑制作用逐渐增强，同时半夏生物碱还可抑制肝癌细胞Bel-7402集落形成，抑制作用呈剂量-效应关系。[5]在乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和前列腺癌细胞株LNCaP 中，β-谷甾醇可依赖于内源性通路加快细胞凋亡速度。[6]赵永娟等[7]研究发现半夏多糖对小鼠肉瘤(S180)，小鼠肝癌(H22)，小鼠艾氏腹水瘤(EAC)均有不同程度的抑制作用(P<0.05)；半夏多糖可诱导SH-SY5Y、PCI2细胞凋亡，对PCI2有抑制生长及增殖作用(P<0.01)。 全蝎能直接抑杀癌细胞，周青等[8]学者总结全蝎的抗肿瘤作用机制主要是通过增强免疫功能和抑制DNA合成、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管生成、直接杀伤肿瘤细胞等来实现的。研究发现，APBMV对人早幼粒细胞 HL-60、人肝细胞癌株SMMC-7721、人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2Z、大肠癌 Lovo 细胞和人胃癌细胞株MGC-803细胞均有显著的细胞毒性和生长抑制作用,可明显抑制细胞的集落形成,并显示出良好的量效、时效关系。[9]地龙的现代药理研究表明其有降压、解热镇痛抗炎、促进伤口愈合、抗血栓、平喘、增强免疫等多种作用，而抗肿瘤作用是其突出效用之一。地龙活性蛋白明显提高了肌体免疫功能，包括提高巨噬细胞的吞噬功能，促进淋巴细胞的转化和BC反应的增强。与此同时，也观察到它对骨髓造血祖细胞有明显促进作用，可用于肿瘤患者辅助治疗。[10]灵芝有抗动脉粥样硬化、对血管内皮细胞有保护作用、对脏器再灌的保护作用、调节免疫、清除自由基、抗肿瘤作用、增强记忆力、降血脂、保肝护肝、改善睡眠、抗病毒等药理作用。[11]而其抗肿瘤作用表现在抑制肿瘤细胞增值、促进肿瘤细胞死亡、抑制肿瘤细胞的侵袭与转移以及免疫调节等多方面。灵芝多糖通过抑制肿瘤细胞黏附并迁移穿过内皮细胞发挥其抗肿瘤作用。[12]黄建琴等研究显示PSG-1在体外可以明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO、IL-1β和TNF-α的能力，同时提高脾淋巴细胞分泌 IL-6、IFN-γ，从而达到提高荷瘤小鼠免疫功能的作用。这些结果进一步表明PSG-1通过体外作用于荷瘤小鼠免疫细胞，增强其免疫功能，实现抗肿瘤的作用。[13]山慈菇以复方入药临床上用于抗肿瘤治疗取得了良好的效果。山慈菇含有秋水仙碱等多种生物碱，可提高癌细胞中的cAMP水平,抑制癌细胞有丝分裂和癌细胞的增殖。吴俊林等[14]研究显示山慈姑能降低甲状腺癌SW579细胞中BCL-2基因的表达水平，促进甲状腺癌细胞的凋亡。山慈姑提取液能诱导胃癌细胞的凋亡，具有抗肿瘤作用。[15]

现代药理学证明绞股蓝具有抗疲劳、降血脂、降血压、促进细胞新陈代谢以及临床治疗防衰老、传染性肝炎、增强免疫、抑制肿瘤、祛痰利尿等作用。绞股蓝总皂苷能降低糖尿病肾病(DN)大鼠尿蛋白，改善肾功能和足细胞相关蛋白的异常表达。[16]绞股蓝多糖能使巨噬细胞数量增加,可显著增强巨噬细胞的吞噬功能,并刺激小鼠巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β，这可能是其发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。[17]绞股蓝皂苷对肝癌细胞SMCC的作用较为敏感，而对肝癌细胞Bel7402作用不敏感。

半枝莲抗肿瘤作用主要通过增强肌体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、抗致突变作用等途径来实现。半枝莲提取物(SBE)具有诱导大肠癌细胞系凋亡和抑制增殖作用，作用强于康复新和露蜂房提取物，其机制可能与Caspase-3基因表达的上调及Bcl-2基因表达下降有关。[18]叶华等[19]研究发现半枝莲多糖能明显促进脾淋巴细胞增殖和脾细胞分泌IL-2和TNF-α等肿瘤抑制因子，有效纠正肿瘤所引起的Thl/Th2失衡,改善肌体的免疫状态,增强肌体的抗肿瘤免疫功能。

以上研究显示化毒补虚方中各药物抗肿瘤作用，本实验以化毒补虚方为主要研究对象，从体外实验中证实了本方对于人肺腺癌A549细胞的抑制作用，并发现在50%浓度含药血清组抑制作用最明显，并且对其形态及超微结构观察发现50%含药血清组处理后细胞形态发生变化并出现凋亡小体，抑制了肺腺癌细胞增殖，促进了其凋亡，为后期在肺癌治疗过程中，以此为主方，针对不同病理类型及病理分期的患者予以适当调整后运用提供理论依据，关于化毒补虚方诱导肺腺癌细胞凋亡调控的具体分子机制将会进一步研究。

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(2016-01-27收稿)

Experimental Study on Function of Medicine-containing Serum of Huadu Buxu Formula on Cell Proliferation and Apoptosis of Human Pulmonary Adenocarcinoma Shaanxi University of Chinese Medicine

QUAN Jian-feng WANG Ying-ying BAI Xiao-na WANG Yu-jin

(Xianyang712000)

AbstractObjective: to observe the function of Huayu Buxu Formula in inhibiting proliferation and facilitating apoptosis of A549 of pulmonary adenocarcinoma in different density at different time. Methods: MTT with Tertrazolium Blue was taken to detect the effect of Huayu Buxu Formula on the cell proliferation, and select the proper density with inhibiting function; an inverted microscope was used to observe cell changes in form, a fluorescence microscope and a transmission electron microscope to observe changes of cell ultrastructure. Results: MTT showed the formula could inhibit the cell proliferation, which was obvious in serum of 50% density and got to the peak at 48 hours; observing the ultrastructure found that A549 changed in form obviously and the apoptotic body could be seen. Conclusion: Huadu Buxu Formula plays a anti-tumor role by killing pulmonary adenocarcinoma cells and inducing apoptosis.

Key wordsHuadu Buxu Formula; human pulmonary adenocarcinoma cells; pulmonary adenocarcinoma; proliferation and apoptosis; experimental study; MTT with Tertrazolium Blue

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1007-5615(2016)01-0001-05

*国家自然科学基金资助项目：No.81072757/H2708；陕西省教育厅资助项目：No.09JK404