不同牛场致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

2016-06-23谢海鹏山东省诸城市畜牧兽医管理局262200

山东畜牧兽医 2016年6期

谢海鹏　郭召　（山东省诸城市畜牧兽医管理局　262200）

谢海鹏郭召（山东省诸城市畜牧兽医管理局262200）

摘要为了解不同牛场犊牛腹泻的发病原因及致病性大肠杆菌的耐药情况。分别采取山东诸城市某牛场、山东五莲县某牛场和山东胶州市某牛场腹泻或肺、肠黏膜等病死犊牛的病料，进行细菌的分离培养、生化分析及药敏试验。结果表明，犊牛腹泻是由致病性埃希氏大肠杆菌引起，不同牛场的大肠杆菌菌株对同样的抗生素有不同程度的耐药性。结论：引起3个牛场犊牛腹泻及致犊牛死亡的病原均为大肠杆菌，分离菌株对抗生素有不同程度的耐药性。

关键词犊牛腹泻大肠杆菌分离培养生化试验药敏试验

大肠杆菌于1885年首先由Escherich从婴儿粪便中分离到，其后，国内外不少学者报道了本病，并确定了大肠杆菌在引起仔猪下痢中有首要意义［1］。犊牛腹泻大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的主要以犊牛腹泻和败血症为主的一种细菌性疾病，是犊牛的一种常见疫病［2］，多发生于出生后1～2周内的新生犊牛，在我国的各个省份和世界各地的养牛区均有发生。近几年来，随着养牛业规模的不断扩大，犊牛腹泻的病例呈上升趋势，严重影响着犊牛的生长发育和成年后的生产性能，造成了养牛业不容忽视的经济损失［3］。为探讨各地区犊牛腹泻的病因，笔者对安徽、黑龙江和山东部分集约化奶牛场腹泻病死犊牛及严重腹泻犊牛进行病原分离鉴定，并进行药敏试验，对有效的预防该病及研究该病的发展变化趋势具有一定的指导意义。

1　材料

1.1病料分别在3个牛场（山东诸城市某牛场、山东五莲县某牛场和山东胶州市某牛场）无菌采取病死犊牛病料（肺、肠等）。

1.2培养基脑心浸液培养基（BHI）、普通肉汤培养基均由市售商品。

1.3试剂葡萄糖，麦芽糖，V-P试剂，H2S，枸橼酸盐等生化试剂购于杭州天和微生物试剂有限公司。Ex Tap DNA聚合酶，10×Buffer，DNTP、DL Marker2000和溴化已锭（EB）均购于北京全式金生物技术有限公司。细菌DNA提取试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.4主要仪器电热恒温培养箱DRP-9162型（上海森信实验仪器有限公司）、显微镜（NIKON公司）、恒温摇床TH2-300（上海一恒科学仪器有限公）、洁净工作台SW-CJ-2FD型（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、梯度PCR仪S1000（北京金业德祥科技有限公司）、BG-Power600i型电泳仪（西安超杰生物科技有限公司）。

1.5药敏纸片氨苄西林（AM，10μg，批号KL15）、青霉素（P，10μg，批号KL21）、四环素（TC，30μg，批号KL20）、庆大霉素（GM，10μg，批号KL15）、卡那霉素（K，30μg，批号KK28）、氯霉素（C，30μg，批号KJ20）、利福平（RA，5μg，批号KJ17）、环丙沙星（CIP，5μg，批号KL29）。购于温州市康泰生物科技有限公司。

2　方法

2.1细菌分离培养在超净工作台下无菌挑取肠黏膜病变部位，直接划线接种于普通肉汤琼脂平板，置于37℃恒温培养箱内培养18～24h，观察结果［4］。在普通琼脂平板上挑取表面光滑、湿润、半透明的中等大小的菌落，接种于脑心浸液培养基中，放入恒温摇床内震荡8～10h，吸取10ul的菌液分别进行涂片，再革兰氏染色，镜检，观察细菌的形态［5］。

2.2生化试验用已灭菌的接种环蘸取少量的细菌纯培养液分别接于生化微量管：葡萄糖、麦芽糖、棉子糖、蔗糖、H2S、M-P、V-P和枸橼酸盐。置于37℃培养箱内培24h观察结果［6］。

2.3PCR鉴定（1）引物的设计与合成：根据GenBank中大肠杆菌16sRNA基因序列设计扩增引物，F（上游引物）：5’-GAGTGGCGGACGGGTGAGTA-3’；R（下游引物）：5’-GGCTGCTGGCACGGAGTTAG-3’，目的片段427bp，上述引物委托哈尔滨博仕生物有限公司合成。（2）细菌DNA的提取：按照细菌DNA提取试剂盒的使用说明来提取即可，-20℃保存。（3）PCR扩增：以提取的细菌DNA为模板，PCR反应体系50μl：DNA模板2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNTP 2.5μl，10×Buffer 5μl，Tap酶1μl，ddH2O 37.5μl；PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。72℃延伸10min，12℃终止反应。（4）DNA琼脂糖凝胶电泳：取10μl的PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，120V，15min。以DNA Marker DL2000为标准分子量，在紫外灯下观察电泳结果并照相。

2.4药敏试验应用WHO推荐的改良药敏纸片扩散法（K-B法），按照NCCLS上的标准来做：先将纯培养的菌液计数，然后稀释到1～1.5×108cfu/ml。取100μl滴于普通肉汤琼脂平板中，用已灭好的涂布棒涂匀，再用灭菌尖头镊子将药敏片平铺在肉汤琼脂平板上，并且轻轻的压紧，每个平板上贴5个药敏片，药敏片一旦接触平板，就不能在移动。最后将贴纸片的平板底部在下，在37℃恒温培养18～24h，分析结果［3］。

3　试验结果

3.1细菌的培养特性3个牛场的分离菌株（山东诸城市某牛场菌株命名为H1-3、山东五莲县某牛场菌株命名为C2、山东胶州市某牛场菌株命名为1.2）在普通琼脂平板上生长均呈呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑湿润、边缘整齐的圆形菌落。

图1　分离菌株在普通琼脂平板上的菌落形态

3.2染色、镜检结果菌株H1-3、C2和1.2分别取15μL纯培养菌液，涂片，经革兰氏染色后，镜检可观察到G¯无芽孢、散在的杆菌。

图2　H1-3菌株的镜检结果　图3　C2菌株的镜检结果　图4　1.2菌株的镜检结果

3.3生化试验结果在恒温培养箱内取出已接菌的生化微量鉴定管，根据颜色的变化，按照生化试验结果判定标准来判断（有的需要指示剂来进一步的判定）。

表1　分离菌株生化试验结果

3.4PCR鉴定结果取PCR扩增产物5～8μl，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，120V，15min。H1-3、C2和1.2菌株在427bp处均扩增出目的片段，与预计的片段吻合。

图5　PCR鉴定结果

3.5药敏试验结果抑菌环的大小与1994年12月版的《美国NCCLS药敏试验纸片扩散法法规》做对比来分析判定药敏试验结果：

表2　分离菌株药敏试验结果

4　讨论

4.1大肠杆菌的鉴定本试验在3个牛场（山东诸城市某牛场、山东五莲县某牛场和山东胶州市某牛场）中采取的病料，进行实验室诊断。在普通肉汤琼脂平板上的菌落形态与王双山等［7］报道相符，呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑湿润、边缘整齐的圆形菌落。生化试验结果表明，C2菌株和1.2菌株生化结果相同，H1-3菌株的结果与C2和1.2菌株有所不同，但均与《伯杰氏细菌鉴定手册》中介绍相符，为了进一步对菌株的鉴定，利用大肠杆菌16sRNA基因序列设计引物进行鉴定，在目的片段427bp处均有明亮的条带，试验结果表明引起犊牛腹泻的病原为大肠杆菌。

5　结论

从本试验可以看出，引起3个牛场犊牛腹泻或致犊牛病死的病原均为大肠杆菌。药敏试验结果表明：三株菌株均对青霉素和利福平有较强的耐药性，其中H1-3菌株对环丙沙星、卡那霉素和四环素的敏感性很强，；C2菌株对庆大霉素和卡那霉素有较强的敏感性；1.2菌株对四环素、庆大霉素、卡那霉素和环丙沙星仍然有较强的耐药性。可见，不同牛场分离出的大肠杆菌对同种抗生素有不同的耐药性。4.2药敏试验药敏试验结果显示，H1-3、C2和1.2菌株对青霉素和利福平有较强的耐药性。其中1.2菌株对四环素、庆大霉素、卡那霉素和环丙沙星的耐药性很强，但H1-3菌株对环丙沙星、卡那霉素和四环素有很强的敏感性，C2菌株对庆大霉素和卡那霉素也有很强的敏感性。王春分等［8］对大肠杆菌的药敏试验表明，对环丙沙星、庆大霉素较敏感，对青霉素、四环素有一定的耐药性。范伟兴等［9］对62株大肠杆菌分离菌进行药敏试验，结果表明，50%以上菌株对青霉素、四环素有较强的耐药性，对庆大霉素有较高的敏感性。可见，不同地区的牛场分离出的大肠杆菌对相同的抗生素的敏感度不同，这主要是由于不同的牛场使用抗菌药物的种类有关，同时也说明长时间使用单一抗生素或大量的使用抗生素是引起耐药性的重要原因。因此，对大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验，选取敏感度高的抗生素用于治疗，对治愈本病十分有效，对疾病的预防也有一定的意义。

参考文献

［1］苏丹萍，赵彦宗，陈敏鸿等. 广东地区部分猪场大肠杆菌的分离鉴

定及药敏试验［J］. 畜牧与兽医， 2010， 42（7）∶ 80-81.

［2］方光远，张姝，樊婕等. 犊牛腹泻大肠杆菌疫苗的研制与应用［J］.中国奶牛， 2008（8）∶ 36-38.

［3］元振杰，马勋，王燕. 致犊牛腹泻大肠杆菌对小鼠致病性及药物敏感性试验［J］. 家畜生态学报， 2011， 32（3）∶ 60-64.

［4］常新耀，谢红兵，魏刚才等. 鸡大肠杆菌的生化特征·致病性及药敏试验［J］. 安徽农业科学， 2008， 36（11）∶ 4536-4538.

［5］孙协军，陈琴琴. 六安市鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.畜牧与饲料科学. 2008（5）∶ 43-45.

［6］白同臣，曲海波，吴金等. 鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］.黑龙江畜牧兽医， 2007（9）∶ 78-79.

［7］王双山，张敬礼，刘定昌等. 肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］. 河南农业科学， 2003（6）∶ 43-44.

［8］王春分，吴萍. 17种抗菌兽药对猪鸡大肠杆菌和金葡萄球菌的药敏试验研究［J］. 沈阳农业大学学报， 1999， 30（4）∶ 454-456.

［9］范伟兴，胡敬东，肖传发等. 鸡大肠杆菌原特性的研究［J］. 中国家禽， 1996（5）∶ 31-32.

中图分类号：S852.61+2