用PCR法从山东省某屠宰场屠宰鸵鸟体内分离滑膜炎支原体的研究

李静萍　盖晋宏

（山东畜牧兽医职业学院　山东 潍坊　261061）



用PCR法从山东省某屠宰场屠宰鸵鸟体内分离滑膜炎支原体的研究

李静萍盖晋宏

（山东畜牧兽医职业学院山东 潍坊261061）

摘要滑膜炎支原体常常引起禽类呼吸道疾病和关节炎，与病毒、细菌混合感染，导致呼吸道症状加重，死亡率增高，给养禽业带来严重损失；53份屠宰鸵鸟的肺和气管分别用PCR法和微生物检测法进行分离、鉴定。通过对支原体16SrRNA基因的特异性扩增（163和207碱基片段），PCR法检出25份阳性，微生物法检出17份阳性。本研究表明PCR法是快速、高效鉴定鸵鸟感染滑膜炎支原体的检测方法。

关键词滑膜炎支原体PCR微生物检验法

支原体（Mycoplasmas）是一类介于细菌和病毒之间的无细胞壁原核生物。当前养禽业中，常见禽支原体病为鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum， MG）、鸡滑膜炎支原体（Mycoplasma synoviae， MS）和火鸡支原体（Mycoplasma meleagridis， MM）三种类型。鸡毒支原体主要引起鸡的慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease，CRD）继发感染后容易引发严重的气囊炎［1］。鸡滑膜炎支原体主要引起鸡的亚临床呼吸道感染，但是当混合感染新城疫（ND）或者传染性支气管炎（IB）时，可引起气囊感染［2］；有时候，滑膜炎支原体也可以引起鸡和火鸡的关节炎，表现为滑膜炎、腱鞘炎和滑膜炎，支原体感染引起的跛行和呼吸困难导致生长速度下降和产蛋量下降。火鸡支原体（Mycoplasma meleagridis， MM）主要发生在火鸡，表现为气囊炎和骨骼发育畸形。支原体可以经卵传播，感染支原体的种禽，其种蛋孵化率和雏鸡成活率均会出现明显降低。定期检测，快速确诊，并及时清除阳性种禽，是防止支原体散播的有效措施。实验室诊断起着十分重要的作用，但是支原体菌体较小、形态多样、培养要求高、生长缓慢以及支原体种属之间交叉抗原存在等特性，限制了微生物培养法和血清学方法在支原体检测中的应用［3］。PCR技术是一种模拟体内DNA复制的体外扩增方法，比培养法快速、灵敏、简便。对难以用培养法和血清学方法检测的支原体，PCR技术更显其优越性。

应用滑膜炎支原体特异性PCR法和微生物检测法从山东省某屠宰场屠宰鸵鸟肺和气管样品中分离滑膜炎支原体，通过2种方法的比较，确定最佳检测方法。

1　材料与方法

1.1样品采集与运送

采用多重随机抽样法，无菌采集53份屠宰鸵鸟肺，以PPLO为介质，4℃保存，12h内送往实验室。

1.2分离培养

1.2.1材料与方法（1）MS平板凝集抗原及抗血清购自中国兽药监察所。（2）培养基制备 MS培养液由PPLO肉汤，10%猪血清，5%新鲜酵母提取液，0.02%NAD组成。

1.2.2分离培养将肺剪成2～3mm2小块，置入液体培养基中，加盖，置于37℃培养，24h后除去严重浑浊和产气者（瓶盖被崩开），液体变黄者按1∶5的比例移植于新鲜培养基内，和未变色者一起继续培养，如此反复3～4次，液体不出现变化者弃掉，出现变化者同时移入固体培养基，5～7d后观察有无菌落生长，若有可疑菌落则挑取后继续接种液体培养基与固体培养基进行分离纯化，直至得到特征性的纯化菌落。

1.3平板凝集试验

在载玻片上滴加几滴生理盐水，沾取疑似菌落与生理盐水混合（如果出现自动凝集或者悬浮物浑浊，将载玻片废弃）。将50ul滑膜炎支原体阳性血清和菌落悬浮液混合，如果在1～2min中内出现凝集，则确定为滑膜炎支原体。

1.4DNA提取

将1.0ml对数生长末期的液体培养物置于1.5ml离心管中，13000r/min低温离心30min，用0.15ml/L PBS（pH=7.2）洗涤2次；用600mlTE缓冲液重悬沉淀，然后加10% SDS 30µl和20mg/ml的蛋白酶K 3µl，轻轻混匀后于37℃过夜；加入10mg/ml的RNAase5µl，56℃孵育60min；用等体积酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）抽提，10000r/min低温离心5min，取上清液移入另一离心管中，加入等量纯氯仿，然后13000r/min离心5min。将上清液移入一支新离心管中，加入1/10的3mol/L醋酸钠和2倍数体积的无水乙醇，-20℃过夜；低温离心，10000r/min，10min，弃上清液；用200µl 70%的乙醇洗涤沉淀，低温离心，10000r/min，15min，然后56℃烘干；用2µlTE缓冲液溶解结晶，4℃保存。

1.5PCR扩增

1.5.1引物合成根据GenBank中公布的滑膜炎支原体的基因序列，应用Primer5.0引物设计软件设计如下2对特异性引物（表1），均由SPAFAS公司合成。

表1　用于鉴定滑膜炎支原体的引物核苷酸序列

1.5.2反应体系及条件见表2。

表2　PCR反应体系

扩增条件为：94℃预变性5min，95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，循环30次，最后72℃延伸10min。

1.6PCR产物的电泳检测

10µl扩增产物加2µl载样液，在80V电压，1%的凝胶上进行电泳。凝胶内加入0.1%溴乙啶（0.5µg/0.1ml）。电泳液为TBE缓冲液。紫外线灯下显示扩增结果，并一次成像拍照。

1.7PCR反应特异性和灵敏性检测

1.7.1PCR反应灵敏性检测取滑膜炎支原体模板DNA样品，测初始浓度为275ng/µl，用无菌去离子水依次作10的倍比稀释，采用PCR反应体系和条件进行PCR扩增。以16SrRNA基因设计的引物进行扩增结果，其敏感性达2.75 ×10-8ng/µl。

1.7.2PCR反应特异性检测应用滑膜炎支原体、鸡毒支原体、沙门氏菌的DNA和超纯水，分别作为PCR反应模板，在上述试验确定的PCR反应体系和反应条件下进行PCR的特异性试验。只有滑膜炎支原体扩增出特异性条带，而其他的均未见条带。

2　结论

2.1细菌学

本试验中，53份鸵鸟肺样品，经PPLO固体培养特殊培养，检出17份阳性样品。

图1　PCR扩增结果M，DNA Marker；（+），阳性（-），阴性；1-8，样品

图2　PCR扩增结果M，DNA Marker；（+），阳性；（-），阴性；1-8，样品

2.2PCR反应

支原体在肉汤培养基上生长，导致培养基颜色变化或因为支原体的生长代谢引起培养基浑浊。53份疑似样品经PCR检测，25份样品检测结果为支原体阳性，且都在支原体核酸的163bp区域显示特异性扩增（如图1）。25份阳性样品经PCR分析，13份样品检出滑膜炎支原体检出率为52%（如图2）。用微生物培养法对53份样品进行检测，17份样品检测结果为阳性。两种方法检测结果对比显示见表2。

表2　53份样品PCR病原学检测和微生物学检测结果比较　（%）

研究表明，屠宰的临床检查健康的鸵鸟肺分离到滑膜炎支原体，表明鸵鸟可以感染滑膜炎支原体。

3　讨论

（1）本研究采用PCR病原学和微生物培养检测，从屠宰场屠宰鸵鸟体内分离到滑膜炎支原体，证实了鸵鸟感染滑膜炎支原体。（2）在病原分离过程中，病料采集和培养条件都非常难，而且耗时长，以致在临床上很难分离到MS。此项研究对某屠宰厂屠宰鸵鸟利用ELISA进行血清学调查，对其中的阳性、阴性鸵鸟进行肺样品采集，经过处理后进行PCR扩增，结果表明ELISA血清学检测阳性的鸵鸟用PCR检测结果同样为阳性，ELISA血清学检测阴性的鸵鸟用PCR检测结果亦为阴性，二者的检测结果符合率为100%，表明PCR方法可用于MS临床检测。PCR检测是一种对微生物培养和血清学鉴定法的有效替代或补充。（3）目前，国外许多国家禽支原体诊断试剂盒已研制成功，但多为检测血清抗体，费用昂贵，不适用于大规模的检测。目前国内研究建立的多重PCR反应能在一个反应中同时检测几种支原体病原，简便易行，敏感性高，特异性强，适合大规模养殖场的疫病监测［4］。

参考文献

［1］ 郭伟娜. 鸡毒支原体感染的流行和控制［J］. 山东畜牧兽医， 2010，31∶ 80-81.

［2］ 刘建设， 尹逊同. 鸡滑液囊支原体病的诊疗［J］. 山东畜牧兽医，2009， 12∶ 91.

［3］ 任杰， 张绍芬， 张映. 3种PCR引物对猪瘟活疫苗中支原体污染的检测［J］. 中国畜牧兽医， 2008， 35（10）∶ 39-42.

［4］ 张磊， 李颖， 王慧. 3种禽支原体多重PCR检测方法的建立及应用［J］. 中国畜牧兽医， 2011， 38（8）∶ 77-80.

［5］ Seifi S， Shirzad M. Incidence and risk factors of Mycoplasma synoviae infection in brdiler breeder farms of Iran， Veterinary World J. 2012； 5（5）∶265.

［6］ Whitcomb RF， Gasparich GE， French FE， Tully JG， Rose DL， Carle P，et al.Spiroplasma syrphidicola sp. nov.， from a Syrphid Fly （Diptera∶Syrphidae）. J. Syst. Evol.1996； 46（3）∶ 797-801.

［7］ Salisch H， Hinz KH， Graack HD， Ryll M.A comparison of a commercial PCR-based test to culture methods for detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in concurrently infected chickens.Avian Pathol. 1998； 27（2）∶ 142-7.

中图分类号：S852.62

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2016）06-0004-02

收稿日期：（2016-03-16）