循环肿瘤DNA与肿瘤精准治疗

高 芃，李金明

(北京医院临床检验中心，北京 100730)

循环肿瘤DNA与肿瘤精准治疗

高 芃，李金明

(北京医院临床检验中心，北京 100730)

目前治疗肿瘤的手段多种多样，已经不完全局限于传统的手术切除及放化疗等，分子靶向治疗药物的普及使“精准医学”正逐步被应用到临床肿瘤领域。随着基因组学及生物大分子技术的日渐成熟，肿瘤精准医学将个体疾病的遗传学信息、诊断、治疗三者结合，使肿瘤的诊治更具有针对性、靶向性和特异性。因此，找到一种可以实时监测肿瘤状态的标志物至关重要。循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA，ctDNA)是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放的一种游离DNA，由于其在血液中循环，所以对ctDNA的检测可以及时反映肿瘤状态。目前ctDNA检测已应用于肿瘤的早期诊断、靶向治疗和预后判断等方面，由于高度特异性及灵敏性的新技术不断出现，检测ctDNA可作为一种“液体活检”，具有很好的临床应用前景。

肿瘤；循环肿瘤DNA；液体活检；靶向治疗

肿瘤是严重危害人类生命健康的一类慢性疾病，随着肿瘤分子生物学的发展，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断及靶向治疗。目前，实体瘤的遗传图谱是从手术或活检组织标本中取得。但是，组织活检标本不能反映其异质性，且由于获取标本采用侵入性手段，给患者带来一定痛苦。因此，寻找可以替代肿瘤组织活检标本并具有高度敏感性和特异性的肿瘤标志物具有十分重要的意义。近年来不断有报道，血游离DNA在健康人的血液中含量极低，但当机体处于特殊疾病状态(如肿瘤、炎症疾病和组织创伤等)时[1]，其含量明显上升，且在肿瘤患者中游离DNA还存在DNA完整性、微卫星变化、基因突变、DNA超甲基化及染色体基因重排等肿瘤特异性的改变[2]，同时由于检测血液样本具有容易获取、快速简便且无创伤等优点，因此，检测肿瘤患者血中游离DNA可视为一种“液体活检”。2015年，MIT Technology Review杂志将“液体活检技术”评为2015年度十大突破技术之一，有力证明了液体活检技术具有强大的发展潜力和前景。本文就游离DNA的来源、生物学特点、检测方法及其在肿瘤治疗及诊断中的临床意义做一综述。

1 血游离DNA、循环肿瘤DNA(ctDNA)的来源及生物学特点

血游离DNA又名循环DNA，是指血循环中具有DNA双螺旋结构的核苷酸片段，分子量0.5～3 kb。在血液中，其一部分以游离形式存在，另一部分通过与蛋白质结合成复合物或附着在细胞表面[3]。1948年Mandel和Métais首次发现血中存在细胞外核苷酸[4]。在将纯化后的游离DNA注于小鼠体内的试验中，结果显示血循环中的双链DNA存在时间长于单链DNA，环状病毒DNA存在时间长于线性DNA[5]。血游离DNA可由肝脏和肾脏清除，根据其片段大小及形态不同，其半衰期可从15分钟到数小时。研究表明，正常人血游离DNA大多来源于血细胞，其含量极低，在100 μg/L之下，平均约为30 μg/L[6]，而肿瘤患者的外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞坏死凋亡后扩散，或增生活跃肿瘤细胞的释放。肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放出可以在人体血液系统中不断循环的肿瘤基因组游离DNA片段，称为ctDNA[1]，其浓度可高达1000 μg/L，平均值为180 μg/L[7]。肿瘤负荷与ctDNA释放的含量直接相关[8]。对于一个肿瘤负荷为100 g(3×1010个癌细胞)患者，每天约有3.3%的肿瘤细胞DNA进入血循环[9]，经低浓度的琼脂糖凝胶电泳分析表明其片段大小在一般在70～200 bp，最大片段可接近21 kb[10]。肿瘤患者中ctDNA还会出现肿瘤特异性的改变：如DNA完整性的改变、癌基因或抑癌基因的突变、基因的甲基化异常、微卫星改变、线粒体DNA荷载水平改变以及染色体基因组重排等。见表1。

表1 血游离DNA与ctDNA之间生物学特点对比表

2 ctDNA的检测

随着对肿瘤认识的不断深入，目前可在基因水平上进行肿瘤相关分析。现临床上使用石蜡包埋的组织切片获取肿瘤相关基因信息，但随着对肿瘤分析日益增多，组织活检样本出现了很大的局限性，如很多患者无法进行手术取样，某些肿瘤解剖位置不便进行穿刺，穿刺本身带来的临床危险[11]及反复取材带给患者巨大痛苦等。当然，组织样本最大的局限性是肿瘤的高度异质性[12，13]，包括：不同患者间的异质性、原发灶内部异质性、原发灶与转移灶之间的异质性以及不同转移灶之间的异质性。携带高度异质性肿瘤组织样本无法反映真实的疾病状态，给临床带来了很大的干扰。与传统的组织学样本相比，检测血中ctDNA具有巨大的优势，见表2。随着对ctDNA认识水平的不断提高，ctDNA定性、定量分析对肿瘤患者具有重要的临床意义。因此，ctDNA的标本采集要求与检测手段不断受到研究者的重视。

表2 组织活检与液体活检优缺点对比表

2.1 ctDNA的检测样本要求及提取过程 检测ctDNA需要1 ml血清或3 ml血浆。处理血浆时，血液需放于含有EDTA的抗凝血剂中，细胞通过离心与上清液或血浆分离。血清在血液凝结后被收集，离心去细胞后与血清分离[14]。收集的血浆或血清用专用试剂盒提取ctDNA。但有文献指出[15]，当比较血清和血浆时，虽然血清中DNA量较多、质较纯，但是由于其很易降解，因此降低异常基因检测的阳性率。并且当血液凝固时，血细胞裂解可向血清中释放正常DNA，可能会对检测结果进行干扰。因此，临床上使用血浆作为检测ctDNA的最佳取样标本。

为了更加准确地测量ctDNA的含量、分析ctDNA中肿瘤特异性基因的改变，对其检测样本的采集与提取也有严格要求：采新鲜外周血8～10 ml，放入专用的含EDTAK3抗凝血剂和细胞防腐剂的ctDNA BCT管中，轻轻倒转8～10次，保证其充分混合，因为混合不充分或不及时均可能影响检测结果的准确性。在4～37 ℃常温保存和运输，禁止冷藏或冷冻保存[16]。

2.2 ctDNA的检测方法 由于肿瘤分离出的DNA的质量和数量变化极大，因此需要高特异性和高灵敏性的方法检测ctDNA。ctDNA的检测范围为0.01%～93%[17，18]。研究者使用许多不同的方法如：数字PCR，基于流式技术的磁珠乳液扩增方法(bead emulsion amplification magnetic，BEAMing)、实时荧光定量PCR及高通量测序(next generation sequencing，NGS)等来定性、定量检测DNA的基因突变以确定ctDNA的存在。

数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的DNA 模板，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。可以实现单分子DNA绝对定量[19]。dPCR在超过75%的胰腺癌、子宫癌、大肠癌等患者中使用数字PCR可检测到ctDNA，在原发性脑癌、肾癌及前列腺癌中的检出率约为50%。Beaming技术结合了数字PCR和流式细胞仪，每一类DNA分子都会专一地与磁性微珠相连接，通过流式细胞仪检测每个磁珠的荧光标记来分析DNA分子之间的差异[20]。其用于检测血液样品中已知基因突变具有不错的效果，即使在非常低的拷贝数亦是如此。它比大多数竞争技术更敏感，同时也可使拷贝数量化[21]。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[22]。扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，若引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此，根据已知点突变设计出引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开[23]。

由于高通量测序技术的发展，一次性对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定成为可能。近年来，已经有研究者采用NGS法检测NSCLC血浆中的ctDNA，然而其敏感度低、检测成本高以及对患者选择性强，只适用于少数的患者[24]。由于对NGS法的不断改进，基于NGS的新型ctDNA检测方法越来越多。肿瘤个体化分析深度测序法(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq)利用定制化的突变位点库作为筛选器，对样本进行靶向捕获后再进行新一代测序，通过在不同级别的肺癌患者中验证，检测ctDNA的灵敏度更高，能检测到低至0.019%的ctDNA水平，特异性可达到96%，突变检出率为0.02%，可以得到满意的检测效果，与全外显子测序相比经济可行[25]。标记扩增深度测序技术(tagged-amplicon deep sequencing，TAM-Seq)具有两步扩增[26]：预扩增时利用特异性引物进行15个循环的目标区域扩增，再利用通用不同特性的接头标签进行二次扩增，通过双向重复测序提高了测序精度，其突变频率检出率可达2%，具有高度灵敏度和特异性且测序通量高，因此测序时间和成本显著下降。见表3。

表3 ctDNA的检测方法对比表

3 ctDNA在肿瘤精准治疗中的意义

近年来，随着对ctDNA研究的不断深入，ctDNA的检测对肿瘤具有越来越重要的意义。通过监测ctDNA含量的变化，可以对肿瘤高危人群进行早期筛选。通过对ctDNA水平变化分析，能够获得来自肿瘤病灶(原发灶和转移灶)相关的基因改变信息，利用这些肿瘤特异性基因改变，可以实时监测肿瘤进展，指导靶向治疗药物，实时监测耐药变化，监测肿瘤复发及评估预后等。

3.1 肿瘤早期筛查 ctDNA水平的升高对肿瘤高危人群的早期筛查和肿瘤早期诊断具有重要意义。Jahr[18]通过检测结肠癌和健康人中的血清DNA水平和CEA 水平，表明结肠癌患者ctDNA水平比健康人明显升高，并提示可将血清游离DNA 与CEA 进行联合检测，并将其作为早期结肠癌筛查指标。Toth 等进一步将ctDNA 甲基化指标应用于结直肠癌的早期筛查[33]。Chan等[34]的研究结果也说明肺癌患者与健康人的ctDNA含量之间存在显著性差异，检测ctDNA水平可用于肺癌的早期筛查。

3.2 靶向治疗药物选择 检测ctDNA的目的是检测肿瘤基因中特定位置的基因缺陷，并针对此种基因改变指导临床对晚期肿瘤患者靶向治疗药物的选择。检测肿瘤患者ctDNA中肿瘤特异性基因发现，携带EGFR激活突变的患者经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs)治疗较常规化疗具有更高的有效应答率(有效率可达到60%～72%)和更长的PFS[35]，其中携带EGFR 19外显子缺失的患者PFS延长的最为明显[36]。因此，对于EGFR突变型患者应将EGFR-TKIs作为一线治疗药物[37]。Allegra等[38]指出用抗EGFR抗体药物治疗转移性结直肠癌时，患者要进行肿瘤基因型测试，当检测出KRAS12或13号密码子基因突变时，应避免使用抗EGFR抗体对其进行治疗，选用EGFR单抗(西妥昔单抗或帕尼单抗)对其进行治疗有效。Shaw等指出非小细胞肺癌中ALK重排阳性的患者对ALK激酶抑制剂敏感，可以选用克里唑替尼治疗[39]，总缓解率可达65.7%，治疗组肺癌相关症状显著改善[40]。具有BRAF突变的黑色素瘤患者中，应用威罗菲尼可以延长其生存期[41]。见表4。

表4 肿瘤相关基因改变与靶向治疗药物

3.3 靶向治疗耐药实时监测 尽管靶向治疗药物为针对特定类型基因改变的肿瘤治疗带来里程碑式的意义，但近年来很多文献表明患者会出现继发性耐药现象。通过监测ctDNA中肿瘤特异性基因的改变，可以对耐药情况进行实时评估。Yun等[45]指出晚期非小细胞肺癌患者中出现EGFR耐药突变T790 M通过其激酶结构域增加与ATP活性对吉非替尼产生耐药性。Shi[46]通过对黑色素瘤的全基因组测序确定BRAFV600E扩增对BRAF抑制剂威罗菲尼产生继发性耐药，这种耐药性的产生可能与受体酪氨酸激酶或N-RAS基因上调有关[47]。见表5。

表5 针对靶向治疗产生的获得性耐药突变

3.4 肿瘤微小残留病灶导致肿瘤复发的监测 ctDNA可作为肿瘤切除术后微小残留的潜在标志物并可能确定患者是否复发。术后或经治疗后ctDNA水平与术前无明显变化或降低不明显，提示患者体内含有肿瘤微小残留病灶，可导致复发。用切除后的肿瘤组织确定针对每个患者自身的基因突变谱并做成针对每位患者的突变特异性探针，用于检测并定量切除术后患者体内的ctDNA，随访2～5年，用ctDNA含量衡量患者在术后微小残留病灶的存在，其检测具有极高敏感性[52]。经手术切除后的食管癌患者，定量检测ctDNA水平降低至正常人水平，但随访12个月后，2例血清DNA水平持续升高、4例血清DNA下降后再次升高者复查时出现明显复发、转移[53]。

另外，术后突变DNA的出现与肿瘤复发间存在很强的关联性。在肠癌和卵巢癌完全切除术后的骨转移患者的复发转移原因是由于原发性卵巢癌中R273 h TP53突变的存在[54]。术后大肠癌患者中检测肿瘤特异性突变，如TP53、KRAS等，可以确定疾病的复发率，其灵敏度和准确度高达100%[55]。有研究指出，在乳腺癌、肺癌及口腔鳞状细胞癌中，疾病复发和特定肿瘤畸变(如KRAS、APC、TP53突变)中有一致性关系[56～58]。

3.5 肿瘤实时治疗监测与预后评估 ctDNA 能实时显示肿瘤患者体内肿瘤负荷的动态信息，可用于观察治疗效果，为评价疗效、预后提供实验依据。经手术治疗后的乳腺癌患者血液中ctDNA含量显著降低[59]，且经一段时间监测ctDNA水平，无上升趋势，表明经手术治疗后预后良好。在18例结直肠癌患者[52]中，第一次手术进行局部切除时，检测ctDNA含量并没有降低，第二次手术完全切除时，ctDNA含量降低明显。另外，还可通过定量检测增加的基因拷贝数评估特定的基因扩增预测疗效，如检测肺癌中的MET扩增可以预测肺癌患者对抗EGFR抗体的治疗效果[60]。在转移性结直肠癌患者中使用定量PCR检测ctDNA中KRAS突变水平，低水平的KRAS突变说明使用第三代西妥昔单抗和伊立替康治疗后可以稳定疾病状态[61]。高浓度血浆KRAS和BRAF突变提示结直肠癌靶向治疗后预后不良。

4 展望

随着分子生物学技术的不断发展与改进，对ctDNA的检测水平也不断提高，其检测方法具有高度特异性及灵敏性，可作为一种有效的非侵入式肿瘤诊断方式。通过对肿瘤患者与健康个体ctDNA的差异，可以评估肿瘤的分子异质性，为肿瘤患者确定靶向治疗药物，评价药物疗效，检测肿瘤发展进程等。但是同时，我们意识到ctDNA还存在一定的改善空间，对于ctDNA检测水平的标准化方面需要做出努力。随着人们对肿瘤基因突变的深入研究，肿瘤特异性基因突变检测在临床肿瘤应用检测上逐步普及，而伴随近年来NGS的发展，为 ctDNA基因突变 NGS检测提供了条件。但经文献查阅后发现，现尚无用于NGS的ctDNA质控品，故急需制备ctDNA质控品，将此ctDNA基因突变质控品应用于全国各级医院以进行高通量测序的质量评价，以达到对于ctDNA检测水平进行标准化的目的。

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Circulating tumor DNA and tumor precision treatment

GAO Peng，LI Jin-ming

(Clinical Laboratory Center，Beijing Hospital，Beijing 100730，China)

LIJin-ming

Up to now，there is a variety of treatments for tumor in addition to traditional surgical resection，radiotherapy and chemotherapy.The precision medicine based upon molecular targeted-therapy drugs has been gradually applied in clinical oncology.With gradually mature of genomics and biological macromolecules technology，tumor precision medicine that combines genetic information，diagnosis and treatment in individual disease makes tumor diagnosis and treatment more pertinent，targeted，and specific.Therefore，it is of crucial importance to find a marker which monitors the state of tumor in real time.Circulating tumor DNA (ctDNA)，a kind of cell-free DNA，is released after tumor cell necrosis or apoptosis.Since they circulate，detection of ctDNA may timely reflect the state of tumor.Currently ctDNA detection has been applied in early diagnosis，targeted therapy and prognosis of tumors.Due to the new technology with high specificity and sensitivity are emerging，detecting ctDNA，as a kind of “liquid biopsy”，has great clinical application prospects.

Tumor；Circulating tumor DNA；Liquid biopsy；Targeted-therapy

李金明，男，研究员，博士，博士研究生导师。中国计量测试学会国家标准物质委员会委员，中国输血协会专家委员会成员，中华医学会检验分会传染病学组和免疫学组专家委员会委员。研究方向：临床分子诊断方法及标准化。

R73-36

A

1672-6170(2016)03-0001-06

2016-04-05)