内生真菌产植物次生代谢产物研究进展

牛丽丽，袁肖寒，顾成波*，刘紫薇，马 慧，宁文娟

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，黑龙江哈尔滨 150030)

内生真菌产植物次生代谢产物研究进展

牛丽丽1，袁肖寒2*，顾成波1*，刘紫薇1，马 慧1，宁文娟1

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，黑龙江哈尔滨 150030)

摘要概述了宿主植物与内生真菌的关系，总结了内生真菌次生代谢产物结构及生物活性多样性，重点分析了内生真菌规模化生产高价值植物次生代谢产物存在的问题及解决策略，并展望了未来发展方向。

关键词内生真菌；代谢产物；生物活性；共培养；表观遗传

内生真菌是指在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物各种组织和器官的细胞间隙或细胞内部的真菌，且被感染的宿主植物并不表现出明显的病害症状。所有植物种类(包括非维管束植物、蕨类、松柏类和被子植物在内)都被认为和内生真菌是共生关系[1]。内生真菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，目前预测的100万种(或更多)内生真菌中仅有一小部分得到分离培养[2]。

内生真菌的重要意义在于其提供了替代性策略，减少了对生长缓慢的珍稀植物的需求，有助于保持地球逐渐减少的生物多样性，而且微生物源高价值植物化学成分的开发相对更容易和经济，增加了产品可得性并降低了价格。内生真菌的“生物勘探”对发现植物相关次生代谢产物及其类似物以及有治疗用途的新型先导化合物(及其合成修饰)具有重要意义。目前，针对内生真菌的大多数研究集中于筛选能产生新颖或已知高价值的生物分子，但探究这些生物体内新颖的次生代谢产物的产生机制报道较少。通常由基因模块或操纵子编码的次生代谢产物的大规模生物合成的主要障碍在于包括分子水平的调控机制仍有待于全面研究，特别是参与内生真菌植物次生代谢产物生物合成起始和调控的主要深层分子机制。鉴于此，笔者概述了宿主植物与内生真菌的关系，总结了内生真菌次生代谢产物结构及生物活性多样性，重点分析了内生真菌规模化生产高价值植物次生代谢产物存在的问题及解决策略，旨在为利用内生真菌生产高价值植物次生代谢产物提供参考。

1植物与内生真菌的相互作用

自然生态系统中的所有植物都可与内生真菌共生，内生真菌已成功适应宿主的免疫系统，在宿主植物的内部组织内形成种类繁多的微生物群体。这些高度多样性的真菌群对植物群落具有重要意义。内生真菌群体间及其与宿主的交流对植物的生理过程具有重要影响(包括植物代谢产物的生物合成)。在胁迫条件下内生真菌可显著影响宿主表现[3]。内生真菌可能会通过精密改变植物对环境变化的反应，调节植物微生态系统的运行[4]。内生真菌通过赋予植物对生物和非生物胁迫的耐性，如通过增加生物量及降低水分消耗以增加植物的适应性，也能通过改变资源分配来降低宿主适应性。

微生物可能会感知来自植物的任何应激诱导的分子，并且当植物处于某种胁迫状态(如病原菌侵袭)时，存在于植物和微生物内的同源基因簇可能会被交叉激活[5]。宿主遗传因子可能也会显著影响与植物相关的微生物的结构和功能[6]。深入探讨内生真菌与宿主之间的相互作用，有目的性地构建新的内生真菌共生体及植物微生态系统具有十分重要的研究意义。

2内生真菌代谢产物

作为隐藏在宿主植物体内的微生物仓库，其发酵产物具有丰富的化学结构多样性和广泛的生物活性。内生真菌是具有医药活性和农业应用潜力新颖化合物的丰富来源。当首次发现红豆杉属内生真菌Taxomycesandreanae能产生紫杉醇后，科学家把寻找新药源的重点从植物转向了内生微生物上。表1介绍了一些内生真菌产生的宿主植物来源的重要次生代谢产物。

3内生真菌代谢产物生物活性多样性

3.1抗癌活性内生真菌抗癌活性的研究起源于Strobel从短叶红豆杉中分离出来的紫杉醇产真菌Taxomycesandreanae，临床上紫杉醇具有显著治疗卵巢癌和乳腺癌的生物活性。

从假柴龙树中分离得到的内养囊霉属内生真菌Entrophosporainfrequens含有生物碱物质，对人类肺癌、肝癌和卵巢癌均显示强效抗肿瘤活性[43]。

表1　内生真菌合成的一些代谢产物

从茶茱萸科植物中分离得到含喜树碱的2种内生真菌，其发酵产物对结肠癌和卵巢癌细胞毒具有明显作用[44]。从泰国的4个森林中分离得到582株内生真菌，有60株具有抗人类口腔表皮样癌细胞作用和48株对乳腺癌细胞有抑制作用[45]。

从印度植物牛油果的叶分离得到可产生麦角黄素的内生真菌，是一种新型的抗癌剂。内生真菌GliocladicillinsA和B在体外和体内均可作为有效的抗肿瘤制剂，它们能诱导肿瘤细胞的凋亡并且能够抑制黑色素瘤的增值[46]。

3.2抗菌活性内生真菌产生具有抗菌活性的萜类主要有倍半萜、二萜和三萜。从白花牛角瓜中分离得到6株内生真菌显示对人类致病性的微生物和植物病原真菌具有抗菌活性，其中抗细菌活性要强于抗真菌活性，分离得到的苍白弯孢菌对包括革兰氏阴性菌、金黄色葡萄球杆菌、化脓链球菌等均产生抑制作用[47]。

从皇冠花的叶中分离得到的166株内生真菌中，发现有33株至少对烟草赤星病毒、尖孢镰刀菌、葡萄孢菌和腐霉属菌4种植物病原真菌的1种具有抗菌作用，其中毛壳属(Chaetomium)内生真菌抗菌活性最强[48]。

从咖啡树中分离得到17株内生丝状真菌对人类致病菌包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和4种不同血清型大肠杆菌具有抗菌活性，是潜在的特效抗菌剂[49]。

3.3杀虫活性香荚兰属植物中分离得到内生真菌Phomopsisarcheri，其产生的芳香倍半萜烯类物质对恶性疟原虫具有显著的杀虫活性[16]。内生真菌Aspergillusterreus的发酵液中分离得到的丁内酯类化合物具有抗疟疾活性[50]。

从药用植物醉马草中分离出2种内生真菌Clavicepspurpurea和Clavicepschaetomium，该2种内生真菌对棉蚜虫具有显著的抗虫活性[51]。具有杀虫活性的樟脑是从1株藤本植物的内生真菌Muscodorvitigenus中分离鉴定出来的，樟脑球被作为杀虫剂而广泛使用。

从九里香中分离内生真菌Eupenicilliumsp.，其次生代谢物中含有的化学成分具有显著的杀虫活性[52]。黑云杉中分离出的内生真菌Canopleaelegana发酵液中含有2种对云杉蚜虫具有明显毒性的异香豆素。

3.4抗病毒活性在索诺兰沙漠植物橡木中分离得到的链格孢属内生真菌Alternariaalternata在抗艾滋病病毒的检测中显示有显著的抗病毒活性，其含有的环氧二萘嵌苯结构骨架可被操纵产生强大的抗HIV病毒的活性物质[53]。

从七叶兰的叶子中分离得到内生真菌Diaporthesp.产生2种新的苯骈吡喃酮类物质，能够抑制结核分枝杆菌毒性菌株的生长，从而达到抗结核病的作用。分离自内生真菌PestalotiopsisficiW106-1的5个结构新颖的环丙烷衍生物(Pestafoficiols A～E)具有抑制对HIV-l病毒在细胞株C8166中复制的活性[54]。

3.5抗炎活性通过深层发酵培养内生真菌腐皮镰刀菌FusariumsolaniSD5，获得了胞外多糖，有体外抗炎活性和抗过敏活性[55]。对50株温郁金内生真菌发酵产物进行抗炎活性筛选，发现其中5株具有极显著的抗炎活性[56]。

3.6免疫调节活性内生真菌拥有生产新化合物的能力，是潜在的免疫调节活性物质，这些免疫调节化合物主要分为免疫抑制剂和免疫调节药物。从雷公藤内生真菌Pestalotiopsisleucothes中分离得到3种化合物，该3种化合物在高浓度的条件下能改变T淋巴细胞亚群内的百分比，并且在这类化合物的免疫抑制浓度下，细胞活力并未受到影响[15]。

3.7抗氧化活性抗氧化剂是能保护细胞免受不稳定分子如自由基破坏的物质，自由基介导的反应与退行性疾病如癌症、阿尔茨海默病等有关，目前，仅有少数抗氧化剂得到临床批准。

从木豆叶中分离得到内生真菌MD-R-1，发现内生真菌乙酸乙酯粗提物有较好的抗氧化活性[57]。从乌墨蒲桃中分离得到21株内生真菌，均具有抗氧化活性，其中9株内生真菌具有显著抗氧化活性[58]。

3.8促进植物生长活性感染内生菌的宿主植物比未感染植株往往具有生长快速、抗逆境、抗病害等优势。从美花石斛中分离出来的镰刀菌属(Fusarium)和棘壳孢属(Pyrenochaeta)内生真菌在树皮腐殖土培养基中能够促进植物生长[59]。被特殊内生菌寄生的植物，由于内生菌产生的激素，通常生长更快，更有竞争力，并在特定环境中占优势地位。

内生真菌也能产生生理活性物质赤霉素。内生真菌对植物的生长的有益作用对于农业生态系统十分重要。因为它们在补偿环境扰动时，减少了对化肥的需求，降低了土壤和水污染。赤霉素产生菌与农作物的共生是克服生物胁迫的不利影响的一个有前景的策略，不但增加植物生物量而且改善了在极端环境条件下的植物生长。

3.9其他生物活性 拟茎点霉属内生真菌PhomopsisliquidambariB3生产漆酶，并且通过优化培养条件使漆酶的产量大大增加。从厄瓜多尔北部的兰科植物中分离得到1种内生真菌Phomopsissp.，这种内生真菌可分泌只有在高等植物中存在的挥发性有机化合物桧烯类物质[60]。

狭叶南五味子的134种内生真菌中，有39个变种具有非凡的生物催化功能，它们属于镰刀菌属、青霉菌属、栓菌属、木霉属等多个种属[61]。

从药用植物柳杉叶马尾杉中分离得到2株能够产生石杉碱甲的内生真菌，分别是芽孢菌属的HA15和葡萄孢属的HA23。在一定的优化条件下，石杉碱甲的含量大大提高，其含有的中枢乙酰胆碱酯酶具有高效、可逆、高选择性的抑制作用，可用于阿尔茨海默病的治疗[62]。

4持续提高内生菌次生代谢产物产量的策略

虽然内生真菌能产生高价值的化合物，但应用这些菌株生产高价值的植物化学品仍未取得突破。目前，对无菌培养条件下传代培养的内生菌产量逐渐下降的问题已有广泛共识，成为其生物工艺商业化的主要限制之一。

为实现和完全挖掘能满足工业规模产量的内生真菌次生代谢产物，需要通过必要的菌株改良技术如内生真菌诱变、遗传转化等方法，开发高产量内生菌菌株，使该菌株能在商业化可行的水平上合成次生代谢产物；改良的菌株能够经过各种微生物发酵生物工艺优化策略，如优化发酵参数、添加诱导子和抑制子、前体饲喂、利用吸附树脂/固相载体等，进一步提高次生代谢产物的产量和生产力。

虽然在很多情况下，对无菌培养条件下内生真菌应用生物过程优化策略已增加了产品产量，但通常无菌培养条件下内生菌的基因组不稳定或生物合成基因沉默阻碍了将新分离的菌株用于生物工艺开发的尝试。因此，还要通过其他有效策略(如共培养和表观遗传修饰)应对无菌培养条件下稳定并提高内生真菌生产能力相关的挑战。图1显示了一个无菌培养条件下开发内生真菌次生代谢产物的合理策略。

共培养或混合培养发酵是提高内生菌次生代谢产物产量的一种重要策略。通过设计新型共培养体系，模拟宿主体内微环境，提供给内生菌在植物体内同种类型的促进其繁殖的选择压，提高内生菌体内与宿主关联的次生代谢产物及新型次生代谢产物。不同菌种在共培养期间所经历的竞争或拮抗作用可能会使在无菌培养条件下选择菌株原有化合物产量显著提高，或使以前未被检测到的某种(些)神秘化合物产量得到累积。

真菌生物合成基因簇经常位于染色体的远端区域，以异染色质状态存在。这些基因经常被表观遗传调控转录控制，如组蛋白去乙酰化及DNA甲基化。应用组蛋白脱乙酰化及DNA甲基化操作来修饰染色质，从而调控真菌和其他生物体内的基因表达或基因沉默。因此，可以利用表观修饰(如DNA甲基转移酶和组蛋白脱乙酰酶抑制剂)来诱导染色质重建，作为破解神秘生物合成基因簇的策略。

图1　无菌培养条件下内生真菌次生代谢产物开发的合理策略Fig.1　The rational strategy toward the exploitation of endophytic fungi secondary metabolites under axenic culture

5展望

内生真菌研究的真正意义不仅在于其生态独特性，更在于微生物在宿主体内和宿主植物的协同作用及协同作用所产生的新功能和新物质。未来将内生真菌开发为植物次生代谢产物的体外生产平台，应加强以下几个方面的研究：

(1)借助遗传工程、发酵工程、代谢工程等组合方法，通过各种生物过程优化策略，保持并提高内生菌中高价值的植物次生代谢产物产量。

(2)探索内生真菌内基因沉默的原因，利用混合培养或表观遗传修饰等各种策略激活沉默基因簇的表达来提高无菌培养条件下内生真菌有效成分的产量。

(3)应积极利用包括生物信息学、分子生物学、分子遗传学等跨学科的方法组合，探索在丝状真菌内起作用的、有利于重要先导分子规模化合成的主要调控元件。

(4)各种生物选择压(如病原菌、动物取食等)和非胁迫因子(如植物/内生真菌次生代谢产物的前体及环境条件)可能对内生真菌产生某种高价值天然产物都存在影响。因此，深入了解内生菌与其宿主植物及其他相关生物(真菌、细菌或病毒)和内共生体在双边、三边及多边的相互作用，对内生真菌天然代谢产物的合成具有重要研究意义。

(5)相对于内生真菌次生代谢产物，还缺少对内生真菌生物学、生理学和分子及化学生态学方面的系统了解，加强对这些方面的认识，有利于进一步开发内生真菌的潜在应用价值。

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Research Progress on Secondary Metabolites Produced from Endophytic Fungi

NIU Li-li1, YUAN Xiao-han2*, GU Cheng-bo1*et al

(1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. Life Science and Biotechnique Research Center, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

AbstractThe review outlined the relationship between the host plants and endophytic fungi, and summarized the structures and biological activities of secondary metabolites from endophytic fungi, then highlighted the problems of large-scale production of high value plant secondary metabolites from endophytic fungi and their solving strategies. In addition, it prospected the direction of future development.

Key wordsEndophytic fungi; Metabolites; Biological activities; Co-culture; Epigenetic inheritance

基金项目中央高校基本科研业务费专项(DL13CA02，2572014EA02-3)。

作者简介牛丽丽(1990- )，女，黑龙江鹤岗人，硕士研究生，研究方向：植物内生真菌的筛选及其活性代谢产物。 *通讯作者，袁肖寒，助理研究员，博士，从事天然植物资源开发利用研究；顾成波，副教授，博士，硕士生导师，从事植物内生菌资源开发利用研究。

收稿日期2016-03-06

中图分类号Q 938

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-012-05