高通量LAMP检测常见肠道病原体的可行性分析

疏义林，张雪峰，万　琴，谢进维 综　述，张守德审校

(安陆市疾病预防控制中心，湖北孝感 432600)

·综述·

高通量LAMP检测常见肠道病原体的可行性分析

疏义林，张雪峰，万琴，谢进维 综述，张守德△审校

(安陆市疾病预防控制中心，湖北孝感 432600)

关键词:病原体；LAMP；高通量；分子诊断；传染性疾病

人类粪-口途径传播的病原体主要是病原菌和一些病毒，如志贺菌、沙门菌、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、甲肝病毒、戊肝病毒、轮状病毒、诺如病毒、星状病毒等，它们会引起肠道疾病等。人体携带这些病原体，是严重危害公众健康的重大问题，也是造成食品和水体污染的间接因素。每年我国发生由病原菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件总数的30%～90%，中毒人数占食物中毒总人数的60%～90%，人们的身体健康受到严重危害[1]。目前病毒性肝炎被世界卫生组织(WHO)列为全球第9大引起死亡的疾病，在我国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位[2]。甲型和戊型肝炎病毒，主要通过粪-口途径传播，病毒随粪便排出体外，通过污染水源、食物、食具等传播途径造成散发性流行或大流行。针对粪-口途径传播的病原体的快速检测是预防和控制突发性肠道疾病关键措施，而目前对病原体检测主要依靠病原体分离法、免疫方法和核酸扩增及其衍生技术方法，虽然病原体分离是金标准，但操作繁琐费时；免疫方法敏感性高、操作简单和快速，但易受到其他物质干扰和抗体特异性差异的影响，从而会导致误诊或漏诊；PCR及其衍生技术方法检测快速、敏感性高和特异性强，已经广泛应用于一些病原体的检测，但由于需要特殊仪器设备且操作复杂，导致其不容易在基层单位实验室推广应用于病原体检测。

随着分子生物学技术不断发展，不断产生新的核酸扩增技术。近年来，一种新的恒温核酸扩增技术，环介导等温扩增技术(LAMP)已被开发应用，该技术操作简单、特异性强、灵敏度高、耐受性强，已在病原体快速检测中得到广泛应用[3-14]，有望解决突发性肠道疾病的相关病原体的快速检测的基层应用难题。结合本单位正在开展的LAMP技术检测甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等病原体的相关研究，对LAMP技术进行介绍和其高通量检测12种常见肠道病原体的可行性分析。

1LAMP技术简介

1.1LAMP技术原理LAMP技术是2000年Notomi等[15]人发明的恒温核酸扩增方法。原理是根据序列保守区域设计的一对外引物和一对内引物特异性识别目标序列上的6个相应区域，在Bst聚合酶的作用下进行自循环链置换反应，在60～65 ℃恒温内，60 min内大量扩增目标DNA片段，可达到109copies以上，同时伴随副产物白色焦磷酸镁沉淀的产生。目前，LAMP技术已经发展为普通LAMP、RT-LAMP、实时浊度定量LAMP等。

1.2LAMP技术引物设计LAMP扩增引物包含F3、B3、FIP和BIP引物，能结合目的序列6个不同区域。上游外部引物F3与目的序列F3c 区域互补，下游外部引物B3与目的序列B3c区域互补。上游内部引物FIP，由F2序列和F1c 序列，中间有TTTT连接组成，F2序列与目的序列3′端的F2c 区域互补，F1c 序列与目的序列5′端的Flc 区域序列相同。下游内部引物BIP，由B2 序列和B1c 序列，中间有TTTT连接组成，B2 序列与目的序列3′端的B2c 区域互补，B1c 区域与目的序列5′端的Blc 区域序列相同。引物设计示意图如图1。Loop 引物(Loop F，Loop B)是有助于提高灵敏度，缩短反应时间的引物[16]。LAMP技术的关键就是引物的设计。应用在线LAMP 引物设计软件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e)设计引物序列，结合DNAstar 的MegAlign 和Olig6.0对引物分析，避免引物二聚体等产生，再将设计好的引物，在Gene Bank中进行比对，进一步验证引物的特异性。LAMP 引物设计一般选取一段长约130～300 bp的保守序列作为靶序列。一般引物间距要求：F2的5′端到B2的5′端的距离，最好控制在120～180 bp；F2的前端和F3引物之间以及B2 的前端与B3 引物之间的距离应该在0～20 bp；F2与F1距离和B2 与B1距离保持在40～60 bp。引物的Tm值要求：Tm 主要由模板的GC含量决定，通常Tm 值为60～65 ℃，富含AT区域Tm 值为55～60 ℃，同时引物Tm值应该满足F2>60 ℃，B2<65 ℃，F3和B3

1.3LAMP反应体系及扩增结果鉴别方法LAMP 反应体系包含了模板DNA、dNTP、Bst DNA聚合酶甜菜碱、缓冲液、引物、Mg2+和ddH2O。通常用25 μL反应体系：模板DNA 1～4 μL，FIP、BIP、F3、B3各0.2～2.0 μmol/L，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，Betaine(5 mol/L) 5 μL，MgSO4(250 mmol/L) 0.3～0.8 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL)1 μL，补ddH2O至25 μL，混合后在60～65 ℃保温15～60 min，然后80 ℃以上加热2 min 让Bst DNA聚合酶热失活，反应终止，或者冰浴终止反应。RT-LAMP反应体系(25 μL):RNA模板3～5 μL、FIP、BIP、F3、B3各0.2～2.0 μmol/L，dNTP Mixture(10 mmol/L) 3.5 μL，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，MgSO4(250 mmol/L)0.3～0.8 μL，Betaine(5 mol/L)5.0 μL，AMV反转录酶(200 U/μL) 0.5 μL，Bst DNA Polymerase (8 U/μL)1 μL，补ddH2O至25 μL。产物鉴别方法有琼脂糖电泳，观察梯度条带；在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ，反应结果变成绿色说明有扩增产物生成，没有变色说明无扩增产物生成，注意，在起始反应液中加SYBR Green Ⅰ，会影响到扩增效率；在反应体系中加入HNB，反应结果变蓝色说明有扩增产物，紫色说明无扩增产物；在反应体系中加入一种发荧光的螯合剂(钙黄绿素)，根据有无绿色荧光，肉眼判断扩增结果；通过对LAMP扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀是否形成来判断有无扩增，根据反应产生的焦磷酸镁白色沉淀形成浊度已经开发出一种实时浊度检测仪，可以用于定量分析。加HNB、钙黄绿素和观察浊度方法判断都可以避免开盖子检测。

图1　　LAMP 引物设计示意图

2高通量LAMP技术检测常见肠道病原体的可行性

沙门菌通过标记invA 基因[5]，已经成功鉴别，而且荣研生物科技(中国)有限公司已经推出专门检测沙门菌环介导等温扩增法试剂盒。通过LAMP或RT-LAMP扩增志贺菌ipaH基因[17]，弯曲杆菌旋转酶基因(gyrA)[7]，大肠杆菌O157:H7菌rfbE基因[3]，霍乱弧菌溶血素基因(hlyA)[4]，小肠结肠炎耶尔森菌Ail基因[18]，金黄色葡萄球菌muc基因[19]，轮状病毒VP7基因[20]，Ⅱ型诺如病毒RNA聚合酶基因[6]，星状病毒HAstV-2基因[21]，已经成功达到鉴别目的。目前关于甲肝病毒、戊肝病毒有关RT-LAMP技术检测报道还没有，但关于甲肝病毒、戊肝病毒分子检测报道有很多，如RT-PCR[22-23]、荧光定量RT-PCR[24-25]。对甲肝病毒基因组和报道的PCR技术扩增片段分析得知VP1/VP3衣壳蛋白基因的连接区和编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的3D非结构蛋白基因，它们都具有高度特异性。对戊肝病毒基因组分析得知除ORF1的1 500～3 000碱基有变异外，其他部分特异性和保守性较强，尤其ORF2序列占全部GeneBank序列一半以上，ORF15′端的甲基转移酶区和ORF13′端的RNA依赖的RNA聚合酶区(RdRP)也比较多。选取甲肝病毒和戊肝病毒特异性保守基因，经Primer Explorer V4软件设计出多套用于LAMP扩增的引物，经Primer5.0和Olig6.0综合分析选出几对基本符合LAMP引物设计要求的引物，将设计好的引物，在Gene Bank中进行比对，保证其特异性。这些引物已经进行初步群体扩增试验筛选，已经初步筛选出2组较为理想的引物组，后期将进一步对反应体系优化以及对引物调整和修饰，筛选出最理想引物组和反应体系，最后用荧光定量RT-PCR、测序和酶联方法对其敏感性和特异性进行评估。在同一个水浴锅或者其他恒温控制设备中实现12种病原体高通量LAMP扩增检测，就必须考虑到不同病原体LAMP引物组的Tm值要相近，以便在相同温度下得到高效率扩增。这12种病原体的引物的Tm通过Nearest Neighor法计算发现基本相近，根据文献报道和初步试验发现12种病原体的标记序列在61～65 ℃都可以有效扩增，建议选择63 ℃进行高通量扩增。在防止污染方面：采用在起始反应体系中加入HNB或钙黄绿素，避免开盖子检测；为进一步防止气溶胶，在反应液表面滴加矿物油封住液面；为避免上一次扩增产物的污染，可以用dUTP替代dATP，加UGN酶处理反应液后，再进行扩增反应。

3小结与展望

LAMP技术特点:(1)高效性，在恒温条件下，15～60 min即可完成扩增反应。(2)灵敏性高，比常规PCR高出1～2个数量级，能满足低拷贝数样品的检测，扩增产物靶序列可达到109以上拷贝。(3)特异性非常高，4条特异性引物与目的序列6个区域中任何区域不匹配都不能进行核酸扩增。(4)操作简单，肉眼直接就可以观察到扩增结果。(5) 耐受性较高，主要因为Bst DNA聚合酶的耐受性很好，再加上反应缓冲液中的甜菜碱的作用，使LAMP耐受性高于常规PCR很多，因此样本中一些异物对LAMP反应影响较小，扩增时不需要对样本进行纯化[12]。(6)不需特殊仪器设备，一台恒温水浴锅或者其他恒温控制设备即可，适合大规模筛查、现场诊断和基层单位实验室病原体或疾病检测。但也存在缺点:(1)扩增产物容易产生气溶胶污染，会造成假阳性。目前已经采用加HNB、钙黄绿素和观察浊度等方法避免开盖子检测产生气溶胶污染，在反应液上加封闭液进一步防止气溶胶扩散出来污染实验室，采用dUTP替代dATP，加UGN酶处理反应液后，再进行扩增反应，防止上一次扩增产物的污染。(2)引物设计要求比较高，有些基因序列可能不适合使用环介导等温扩增方法。

随着LAMP技术、分子标记研究深入和不断推广，相关行业已经制定LAMP技术的检测行业标准。不同款式的LAMP扩增仪的推出使LAMP技术的推广更加迅速。为了使LAMP技术能更好的运用于基层临床诊断、现场检测和即时检测，必须在扩增稳定性、缩短扩增时间、定量和找到更简便防止扩增产物污染的检测方法方面努力。凭借敏感性高、特异性强、耐受性强、操作简单、检测结果易判定、成本低廉、适合高通量扩增等优点，LAMP将成为核酸扩增领域的重要技术方法，尤其在病原体快速高通量检测方面有着推广价值。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.034

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)10-1385-03

(收稿日期：2015-12-16)