UPLC法测定拉莫三嗪和奥卡西平活性代谢物血清药物浓度
2016-06-22项茹菡蒋玉凤王婷婷李红健
项茹菡,蒋玉凤*,贾 莉,王婷婷,李红健
UPLC法测定拉莫三嗪和奥卡西平活性代谢物血清药物浓度
项茹菡1,蒋玉凤1*,贾莉2,王婷婷2,李红健2
1.安徽医科大学新疆临床学院,乌鲁木齐 830001;2.新疆维吾尔自治区人民医院临床药学研究所,乌鲁木齐 830001
[摘要]目的建立超高效液相色谱(UPLC)同时测定人血清中拉莫三嗪(Lamotrigine,LTG)和奥卡西平活性代谢物10-羟基卡马西平(Monohydroxy-carbazepine,MHD)浓度的方法。方法色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱温30 ℃,流动相:乙腈-10 mmol/L乙酸铵(20∶80;甲酸调pH=4),流速:0.2 mL/min,进样量2 μL,检测波长240 nm。结果血清中内源性物质对样本测定无干扰,LTG和MHD分别在1~40 μg/mL和1.25~80 μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数r分别是0.999 8和0.999 7。本方法两个化合物准确度RE值在±10%范围内,批内和批间精密度RSD值均<10%,LTG回收率73%~80%,MHD回收率89%~97%。结论本法操作简便、专属性强、灵敏度高、重现性好,符合生物样品的分析要求,适用于LTG和奥卡西平活性代谢物MHD的浓度监测。
[关键词]UPLC;拉莫三嗪;奥卡西平;10-羟基卡马西平;血药浓度
0引言
癫疒间是一组由已知或未知病因所引起,脑部神经元高度同步化,且常具自限性的异常放电所导致的综合征[1-2]。临床上常用的新型抗癫疒间药物有拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)、托吡酯、左乙拉西坦等。其中OXC和LTG是症状性部分性癫疒间发作的首选药物。OXC和LTG主要作用机制不同,临床上经常联合用于治疗顽固性部分性癫疒间,可以增加抗癫疒间疗效,避免不良反应叠加[3]。而这两种药物治疗窗窄、血药浓度个体差异大、不良反应发生率高、服药周期长,且主要服药人群儿童神经系统处于发育阶段,代谢动力学不同于成人,为了便于调整剂量提高疗效、降低不良反应风险、提高服药依从性,临床上有必要对服用这两种药物的患者进行定期血药浓度监测[4]。OXC是一种无活性的前体药物,在体内经肝细胞内的芳基酮还原酶几乎全部转化为10-羟基的卡马西平(MHD)发挥药理活性,临床上通过监测MHD浓度来评价OXC疗效[5]。目前已有关于HPLC法同时测定LTG和MHD浓度的报道[6],然而血清样品提取方法复杂,灵敏度低,分析时间长。本文在参考相关文献的基础上[7-8],建立了灵敏度高、分离度高、分析效率高的UPLC同时测定人血清中LTG和MHD浓度的方法。
1材料与方法
1.1仪器超高效液相色谱(UPLC,美国Waters公司);5430R型低温冷冻离心机可调移液器(德国Eppendorf公司);BP221S型万分之一分析天平(德国Sartorius公司);FJY1002-UVF基因研究型超纯水机(青岛富勒姆公司);SK3200LHC型超声波清洗器(上海科导公司);WH-3微型漩涡混合仪(上海泸西公司)。
1.2药品与试剂LTG对照品(印度Divis公司,批号:2-CRL-0880211,纯度≥98%);MHD对照品(大连生物美仑公司,批号:20140623,纯度≥99%);样本前处理蛋白沉淀剂(美国Abbott公司,批号:20150127-308544);色谱纯乙腈、甲醇(美国Thermo Fisher公司);超纯水由富勒姆超纯水机制备。
1.3方法
1.3.1色谱条件色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流动相:乙腈-10 mmol/L乙酸铵(20∶80;甲酸调pH=4);流速:0.2 mL/min;柱温30 ℃;检测波长240 nm;进样量2 μL。
1.3.2标准溶液的配制分别精密称取LTG、MHD对照品10 mg置于10 mL容量瓶中,加入甲醇定容配制成1 mg/mL的标准储备液。
1.3.3血液样本处理将血液样本3 500 r/min离心5 min,移液枪精密量取上层血清100 μL,置于1.5 mL离心管中,加入样本前处理蛋白沉淀剂200 μL,涡旋混合60~90 s后,以12 000 r/min转速低温高速离心10 min。用1 mL注射器吸取上清液,经0.22 μm针头式过滤器过滤后,注入进样瓶内插管中。
1.4方法学考察
1.4.1专属性将LTG和MHD的对照品储备液分别用甲醇稀释成20 μg/mL的工作液先后进样得LTG和MHD对照品色谱图。取不同来源健康人空白血清样本,混合均匀后取100 μL按“1.3.3”项下方法处理,进样分析得空白血清色谱图。取混合均匀的空白血清80 μL,先后加入稀释好的400 μg/mL的LTG工作液和MHD工作液10 μL,涡旋混匀后按“1.3.3”项方法处理后进样分析得加样血清色谱图。
1.4.2标准曲线与定量下限在90 μL空白血清中加入10 μL不同浓度的LTG、MHD,配制成梯度浓度的加样血清样品,按“2.3”项方法处理后进样,确定使S/N≥10的LTG、MHD浓度,即为定量下限。制备5个独立的定量下限浓度血清样本,进一步验证其浓度是否使S/N≥10。
用甲醇将LTG和MHD标准储备液稀释成不同浓度的工作液。取空白血清80 μL,分别加入10 μg/mL的LTG工作液10 μL、12.5 μg/mL MHD工作液10 μL,配制成LTG血清浓度1 μg/mL、MHD血清浓度1.25 μg/mL的血清样品。按此法依次配制出LTG血清浓度1、2、4、8、10、20、40 μg/mL,MHD血清浓度1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL的血清样品。按“1.3.3”项下方法操作后进样分析,将得到的峰面积作线性回归,得到LTG、MHD标准曲线。
1.4.4常温稳定性和冻存稳定性分别制备LTG(4、10、40 μg/mL)和MHD(5、20、80 μg/mL)低、中、高3个浓度质控样品各5份,放置于室温(25 ℃)下0、6、12、24 h后处理进样测定,每个样品重复测定3次。同样制备LTG(4、10、40 μg/mL)和MHD(5、20、80 μg/mL)低、中、高3个浓度质控样品各5份,放置于-20 ℃冰箱内20 d,取出解冻后处理进样测定,每个样品重复测定3次。
1.4.5冻融稳定性制备LTG(4、10、40 μg/mL)和MHD(5、20、80 μg/mL)低、中、高3个浓度质控样品各5份放置于-80 ℃冰箱内冻存,并反复冻融1、2、3次,每次冷冻时间均超过24 h。将样品处理好后进样测定,每个样品重复测定3次。
1.4.6干扰性试验目前已收集16例服用LTG患者的血清和50余例服用OXC患者的资料,通过询问,发现部分服用LTG、OXC的患者同时服用丙戊酸钠、卡马西平、左乙拉西坦托吡酯。在该方法下将丙戊酸钠、卡马西平及左乙拉西坦托吡酯对照品进样。
2结果
2.1专属性LTG的保留时间是1.84 min,MHD的保留时间是2.67 min,两个化合物在3 min全部出峰且峰型较好,分离度>1.5,对称因子在0.95~1.05之间,柱效>8 000。药物的测定不受血清内源性物质干扰。
图1 拉莫三嗪和10-羟基卡马西平的超高效液相色谱图
注:A.LTG对照品,B.MHD对照品,C.空白血清,D.空白血清+LTG对照品+MHD对照品;1.LTG,2.MHD
2.2标准曲线和定量下限LTG和MHD分别在1~40 μg/mL和1.25~80 μg/mL浓度范围内线性关系良好。该方法下两条标准曲线线性范围分别包含LTG参考有效血药浓度2.5~15 μg/mL[9]、MHD有效血药浓度10~35 μg/mL[10],满足临床测定的需要。
表1 线性回归方程和线性范围
2.3准确度、精密度和回收率本方法准确度RE值在±15%范围内,批内和批间精密度RSD值均<15%,回收率均>70%。符合生物样品分析要求。见表2。
2.4常温稳定性和冻存稳定性LTG和MHD室温6、12、24 h测定的RE值均在±15%范围内,RSD值均<10%,样本放置室温下24 h内能保持稳定。放置于-20 ℃冰箱内20 d,药物RE值均在±5%范围内,RSD值均<10%,表明样本放置于-20 ℃冰箱内20 d能保持稳定。见表3。
2.5冻融稳定性冻融测定计算得到RE值均在±15%范围内,RSD值均<10%,说明血清样品在反复冻融3次的情况下仍保持稳定。见表4。
表2 拉莫三嗪和10-羟基卡马西平的准确度、精密度、回收率(n=5)
表3 拉莫三嗪和10-羟基卡马西平的常温稳定性和冻存稳定性(n=5)
表4 拉莫三嗪和10-羟基卡马西平的冻融稳定性(n=5)
2.6干扰性实验实验发现,丙戊酸钠不能在该方法下出峰,而卡马西平、托吡酯不能在4 min内出峰,100 μg/mL左乙拉西坦对照品进样后在0.8 min左右出峰,峰型较小且和溶剂峰相连。与空白血清色谱图对照发现,该方法下左乙拉西坦峰在血清样本中只能被血清峰掩盖,排除了该方法下合用药物的干扰。
图2 左乙拉西坦对照品的超高效液相色谱图
3讨论
3.1流动相的选择在摸索UPLC条件时,笔者曾选择甲醇-水、乙腈-水、乙腈-乙酸钠,然而对照品峰峰型呈不规则锯齿状,与溶剂峰始终有干扰。当流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-10 mmol/L乙酸铵、乙腈-10 mmol/L乙酸铵(甲酸调pH=4)时,对照品峰型不再出现分叉,有较大的改善。经过比较,其中流动相为乙腈-10 mmol/L乙酸铵(甲酸调pH=4)的条件下,峰宽较窄,峰型较尖,柱效最高。
3.2流动相比例的优化当乙腈∶10 mmol/L乙酸铵=30∶70时,溶剂甲醇、LTG对照品、MHD对照品分别在0.5、0.7、0.9 min左右出峰,1 min内结束色谱分析。溶剂峰和LTG对照品、MHD对照品峰型和分离度均较好。在此条件下,进样空白血清和加对照品血清对比,发现血清中对照品峰包含有小的血清峰。经过调整,乙腈∶10 mmol/L乙酸铵=20∶80,溶剂峰和LTG对照品、MHD对照品峰型和分离度较好,且不受小的血清峰干扰,同时测定两种物质可以在3 min内完成。
3.3提取条件的优化在优化血清样品的提取条件时,比较甲醇、乙腈、甲醇和乙腈混溶、乙酸乙酯、丙酮等有机试剂作为蛋白沉淀剂和雅培公司的样本前处理蛋白沉淀剂的提取效果,发现有机试剂直接沉淀蛋白的效果皆不佳,色谱图杂峰多,而成品蛋白沉淀剂以1∶2的比例就可以获得理想的提取效果,色谱图血清杂峰很少,提取回收率较高。
3.4进样量的确定当进样量为5~10 μL,色谱图完全是分叉峰。减少进样量<5 μL,峰尖不再圆钝,色谱图得到较大改善。继续减少进样量至2 μL,色谱峰得到较高的柱效。
本实验所建立的UPLC同时测定人血清中LTG和OXC活性代谢物浓度的方法按2010版《中国药典》[11]要求进行了方法学验证,结果符合生物样本分析需要,并具有出峰时间短、操作简便、专属性强、灵敏度高、重现性好等优点,满足临床LTG和OXC活性代谢物浓度监测的需要,更有助于医生针对个体癫疒间患者调整剂量,提高疗效,降低不良反应风险,提高服药依从性。
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Ultra performance liquid chromatography spectrometry method for the simultaneous quantification of lamotrigine and oxcarbazepine′s metabolite in human serum
XIANG Ru-han1,JIANG Yu-feng1*,JIA Li2,WANG Ting-ting2,LI Hong-jian2
(1.Xinjiang Clinical College of Anhui Medical University,Urumqi 830001,China;2.Clinical Pharmacy Institute of People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830001,China)
[Abstract]ObjectiveTo establish a method for the simultaneous determination of the concentration of lamotrigine and monohydroxy-carbazepine in serum by Ultra performance liquid chromatography with UV detector.MethodsSerum samples were separated on an ACQUITY UPLCTM BEH C18column (50 mm×2.1 mm,1.7 μm). The column temperature was maintained at 30 ℃ and chromatographic separation was achieved using mobile phase composition with UV detection at 240 nm;acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate solution (20∶80,v/v) (pH adjusted to 4.0 by formic acid) was delivered at a flow rate of 0.20 mL/min. The injection volume was 2 μL. ResultsThe concentration of lamotrigine and monohydroxy-carbazepine had no interference with the endogenous substance in serum. A good linearity was shown in the concentration range 1~40 μg/mL for LTG and 1.25~80 μg/mL for MHD.The linear correlation coefficient (r) was 0.999 8,0.999 7 for OXC and MHD respectively.The intra-day and inter-day precision and accuracy of the quality control samples were within 10.0%.The recoveries were 73%~80% and 89%~97% for OXC,MHD respectively.ConclusionThe method is convenient,accurate,sensitive and of good reproducibility.It conforms to the requirements of analysis in biological samples and is suitable for serum concentration monitoring of lamotrigine and monohydroxy-carbazepine.
Key words:Ultra performance liquid chromatography(UPLC);Lamotrigine;Oxcarbazepine;10-Monohydroxy-carbazepine;Serum concentration
收稿日期:2015-10-12
基金项目:新疆维吾尔自治区人民医院院内资助课题(20140312)
*通信作者
DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605026