川芎嗪对大鼠脑损伤后保护作用的研究

邢淑芳，王　琳

川芎嗪对大鼠脑损伤后保护作用的研究

邢淑芳1，王琳2

1.河北省武安市第一人民医院神经外科，河北 武安 056300；2.河北省唐山市丰南区医院，河北 唐山 063300

[摘要]目的探讨川芎嗪对大鼠脑损伤后的保护作用。方法将60只大鼠随机分为对照组、损伤组及治疗组，每组20只。损伤组、治疗组以改良Feeney自由落体脑损伤模型方式对大鼠制作脑损伤动物模型，治疗组大鼠在脑损伤后接受川芎嗪治疗。实验第14天应用HE染色、电镜观察及水迷宫实验评价脑损伤对大鼠形态学和学习记忆的影响及川芎嗪的保护作用。结果HE染色结果显示，应用川芎嗪注射液治疗后，治疗组正常运动神经元数目多于损伤组；电镜下可见治疗组神经细胞核固缩程度、染色质浓染程度、胞浆空泡化较损伤组减轻。水迷宫实验结果显示，治疗组第1次穿过平台时间较损伤组缩短[(7.68±1.09) s vs. (10.15±2.35) s]，在靶象限活动时间较损伤组延长[(86.14±16.68) s vs. (62.38±19.67) s]，穿过平台次数多于损伤组(6.4±2.3 vs. 3.8±1.6)，差异均有统计学意义。结论川芎嗪治疗可能在脑组织损伤及大鼠学习记忆功能中发挥重要的治疗效应。

[关键词]脑损伤；川芎嗪；水迷宫

0引言

脑损伤是现代社会中的常见病和多发病，其致残率和死亡率均居各种疾病首位，严重威胁人类健康[1-2]。脑损伤可分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段，脑损伤瞬间引起的组织损害称为原发性损伤，由此激发的一系列病理因素参与的神经破坏过程称为继发性损伤。脑损伤后神经凋亡及由此引起的学习记忆障碍是脑损伤常见的继发性损伤，对机体产生的影响有时甚至超过原发性损伤[3]。因此，寻找有关脑损伤后的神经保护措施非常重要，已成为全球共同关注的重大课题。川芎嗪是川芎的有效成分，具有典型的钙离子拮抗剂特性，可扩张微血管和改善微循环[4-5]。已有研究显示，川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤有一定的保护作用[6]，但关于该药对大鼠脑损伤的保护作用研究较少。本研究将川芎嗪用于脑损伤大鼠，探讨其对大鼠脑损伤是否有保护作用。

1材料与方法

1.1实验动物健康Sprague-Dawley纯种大鼠(购自北京实验动物养殖中心)60只，3～6个月，体重300～350 g，雌雄不限，由专一实验室饲养员统一饲养，隔日换垫料，室温保持20 ℃。

1.2实验动物分组实验动物采用单纯随机分组方法，随机分为3组，每组20只。对照组，只行手术，不对脑组织打击；损伤组，制作打击模型，未应用川芎嗪注射液；治疗组，打击模型后应用川芎嗪注射液进行治疗。

1.3模型制备按照改良Feeney自由落体脑损伤模型对损伤组和治疗组大鼠制作左顶叶脑挫裂伤模型[7]。损伤模型装置由底板、固定支架、垂直导引杆、下落击锤和撞击圆锥组成。导杆重84.3 g，击锤重23.1 g，撞击圆锥头端直径4 mm、高2.5 mm。大鼠腹腔内注射10%水合氯醛(350 mg/kg)，麻醉成功后，将其头部固定，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧矢状切开头皮，剥离骨膜显露左顶颅骨，于中线左侧旁开约2 mm，前囟后约2 mm处用牙科钻开一直径为5 mm圆形骨窗，保持硬膜完整。以40 g砝码于25 cm高处通过金属导杆落下，撞击置于硬脑膜上的圆锥上致重型脑挫裂伤，用骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂养。实验过程中维持大鼠肛温在36.5～37.5 ℃，直至苏醒。治疗组大鼠脑损伤后30 min内腹腔注射川芎嗪(山东瑞阳制药有限公司，国药准字H20040367，规格：100 mg/支) 120 mg/kg，1次/d，连续14 d，损伤组大鼠相同时间内给予等量生理盐水注射。

1.4Morris水迷宫实验所有大鼠在开始实验前首先进行4 d的水迷宫实验训练。训练时将大鼠分别从4个不同的入水点入水，引导其在180 s内寻找并爬上安全平台。经过4 d训练后，大鼠都能在180 s内顺利找到平台。训练完成后，将大鼠随机分成3组，分别进行相关处理。14 d后再次进行水迷宫实验，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠在180 s内搜索平台的次数、首次穿过平台的时间及在靶象限内的活动时间。

1.5标本采集及制备水迷宫实验后，大鼠在10%水合氯醛深度麻醉状态下开胸，穿刺左心室，经心依次用体积分数为1%的肝素生理盐水、体积分数为10%的中性甲醛溶液各200 mL灌注。断头并取脑组织标本，一部分标本用于HE染色，一部分标本用于电镜观察。

1.6脑组织HE染色将用于HE染色的标本置于10%中性甲醛后固定24 h。冠状位切取视交叉与正中隆起处组织，常规脱水，透明，石蜡包埋。冠状面连续切片，厚度约5 μm，经粘片剂处理过的载玻片捞片，晾干后置于60 ℃烤箱烘烤4 h后染色。石蜡切片经二甲苯常规脱蜡，100%、95%、80%、70%酒精梯度入水，用蒸馏水冲去残存酒精成分。明矾苏木精染色15 min，自来水漂洗，去浮色(约10 s)。1%盐酸酒精分色30 s，自来水漂洗0.5 h。0.5%伊红酒精溶液染色3 min。70%、80%、95%、100%酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7电镜观察将另一部分脑组织洗净，切成1.0 mm3组织块，置入4 ℃新鲜戊二醛缓冲液中固定2 h后，用1%四氧化锇在4 ℃固定30 min，之后用0.1 M、pH 7.4的PBS液漂洗3次。然后用30%、50%、70%、90%系列丙酮在室温下逐级脱水，每次脱水15 min，最后用100%的丙酮脱水2次，30 min/次。纯丙酮-环氧树脂618包埋剂(1∶1体积比)浸透8 h后环氧树脂618包埋，并修整包块。采用超薄切片机对选择好的半薄切片部位进行切片，切取厚度约50 nm的超薄切片。采用醋酸双氧铀和铅染液(含醋酸铅、硝酸铅和枸椽酸铅)室温下染色30 min，染色后置入40～50 ℃温箱中烘干待用。将超薄切片置于小铜网上，透射电镜下观察细胞超微结构，进行分析、记录数据并照像。

2结果

2.1HE 染色观测病理形态学改变对照组大鼠海马CA1区神经元数目多，排列整齐，形态正常，核仁清晰，神经细胞周围无散在的空泡形成。胞核为蓝色，胞浆淡红色，各组神经细胞在细胞形态、大小和排列上未见明显差别，未见明显病理改变。损伤组：大鼠海马CA1区前角正常的运动神经元数目明显减少，细胞核固缩，部分发生核裂解，神经细胞周围可见较多空泡形成。治疗组：大鼠海马CA1区前角正常运动神经元数目较多，且多于损伤组，部分形态基本正常，核仁清晰，神经细胞周围可见散在的空泡形成，较损伤组减少。

2.2电镜观测病理形态学改变对照组大鼠脑组织电镜超微结构形态基本正常：可见神经细胞结构大致正常，神经元的细胞核大而圆，核仁、细胞膜清楚，染色质密度均一。细胞器可见线粒体和粗面内质网、高尔基体等，血脑屏障的微血管内皮细胞、基底膜结构大致正常。损伤组可见神经元核固缩，异染色质浓染凝集成块，呈环状或新月状，附在核膜周边，核仁裂解，胞质浓缩，胞体皱缩，细胞体积减小，细胞膜内陷呈泡状改变，内质网、高尔基体和线粒体肿胀，空泡样变，线粒体嵴碎裂，胞浆中特征性尼氏体溶解消失；胶质细胞核固缩，染色质浓染聚集，胞浆中有大量空泡形成。见图1。治疗组的神经细胞核轻度固缩，染色质浓染较常温损伤组减轻，胞浆空泡化较常温损伤组减轻。见图2。

图1　损伤组电镜观测病理形态学改变(×14 000)

图2　治疗组电镜观测病理形态学改变(×22 000)

2.3水迷宫实验观察实验第14天，各组大鼠水迷宫实验结果见表1。由表1可见，损伤组、治疗组大鼠第1次穿过平台时间均高于对照组，在靶象限活动时间和穿过平台次数均低于对照组。治疗组大鼠第1次穿过平台时间短于损伤组，在靶象限活动时间较损伤组延长，穿过平台次数较多。

3讨论

《本草纲目》中认为，川芎为血中气药，味辛性温，主要功能为活血化瘀。川芎嗪是川芎的有效成分，有较强的改善微循环、降低毛细血管通透性等功能，临床上主要用于脑供血不足、脑血栓形成等缺血性血管疾病的治疗[8-10]。近年研究显示，川芎嗪可通过抑制脊髓组织中内皮素mRNA的表达，使受损的神经细胞逐渐恢复正常，减轻大鼠急性脊髓损伤后继发性损害的加重[11-12]。但关于川芎嗪对大鼠脑损伤后的神经保护作用研究尚较少。

表1　各组大鼠水迷宫实验结果比较

注：*与对照组比较，P<0.05；#与对照组、损伤组比较，P<0.05

本研究采用川芎嗪注射液治疗大鼠脑损伤14 d后，HE 染色及电镜形态学方面显示，正常运动神经元数目多于损伤组，部分形态基本正常，核仁清晰，神经细胞周围可见散在的空泡形成，且较损伤组明显减少。此外，电镜上可观察到损伤组神经元核固缩，异染色质浓染凝集成块，呈环状或新月状，附在核膜周边，核仁裂解，胞质浓缩，胞体皱缩，细胞体积减小，细胞膜内陷呈泡状改变，内质网、高尔基体和线粒体肿胀，空泡样变，线粒体嵴碎裂，胞浆中特征性尼氏体溶解消失；胶质细胞核固缩，染色质浓染聚集，胞浆中有大量空泡形成。而川芎嗪治疗组电镜下可见神经细胞的核轻度固缩，染色质浓染较损伤组减轻，胞浆空泡化也较损伤组减轻，提示川芎嗪治疗可减轻脑损伤后的神经细胞损害，对脑损伤的修复有一定促进作用，与相关研究结果类似[13-15]。

水迷宫实验结果显示，损伤组、治疗组大鼠14 d后，第1次穿过平台时间均较对照组延长，在靶象限活动时间较对照组缩短，穿过平台次数较少，证实脑损伤对大鼠学习记忆功能可产生严重影响。而第14天时，治疗组第1次穿过平台时间短于损伤组，在靶象限活动时间较损伤组延长，穿过平台次数较多，提示川芎嗪注射液治疗可显著改善大鼠学习记忆功能，使大鼠学习记忆能力明显提高。

综上所述，应用川芎嗪注射液治疗，可以降低脑损伤后脑组织的损伤，改善学习记忆，从而对脑损伤产生一定的保护作用。

参考文献：

[1]曹健锋,晋鑫,史载祥,等.亚低温治疗创伤性脑损伤的研究进展[J].中华神经医学杂志,2015,14(4):444-448.

[2]Cai P,Luo H,Xu H,et al.Recombinant ADAMTS 13 attenuates brain injury after intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2015,46(9):2647-2653.

[3]Tataranno ML,Perrone S,Buonocore G.Plasma biomarkers of oxidative stress in neonatal brain injury[J].Clin Perinatol,2015,42(3):529-539.

[4]蔡莉莉,李敬会,徐剑刚,等.丹参川芎嗪注射液对老年UAP患者血流变学、hs-CRP及脂代谢的影响[J].实用药物与临床,2014,17(3):267-270.

[5]Zhang WJ,Wang JY,Li H,et al.Novel application of natural anisole compounds as enhancers for transdermal delivery of ligustrazine[J].Am J Chin Med,2015,43(6):1231-1246.

[6]王世龙,林原,唐泽耀,等.川芎嗪在各类神经系统损伤中的保护作用及其机制研究进展[J].中国药理学通报,2010,26(4):438-442.

[7]别黎,刘兴吉.创伤性颅脑损伤主要损伤标志物的研究进展[J].中华创伤杂志,2015,31(4):380-382.

[8]张伟民,李瑞芳,付银峰,等.川芎嗪对阿霉素诱导的急性心衰小鼠心肌损伤和凋亡的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2014,(8):708-711.

[9]Cai J,Pan R,Jia X,et al.The combination of astragalus membranaceus and ligustrazine ameliorates micro-haemorrhage by maintaining blood-brain barrier integrity in cerebrally ischaemic rats[J].J Ethnopharmacol,2014,158(Pt A):301-309.

[10]Ni X,Ni X,Liu S,et al.Medium- and long-term efficacy of ligustrazine plus conventional medication on ischemic stroke:a systematic review and meta-analysis[J].J Tradit Chin Med,2013,33(6):715-720.

[11]唐泽耀,王世龙,林原,等.川芎嗪在神经系统的药代动力学及临床药效学应用研究进展[J].中国临床药理学杂志,2010,26(7):535-539.

[12]Lv L,Meng Q,Xu J,et al.Ligustrazine attenuates myocardial ischemia reperfusion injury in rats by activating the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway[J].Ann Clin Lab Sci,2012,42(2):198-202.

[13]王霞,张静.丹参川芎嗪注射液治疗急性脑梗死疗效观察[J].临床合理用药杂志,2011,4(29):70-71.

[14]Liu X,Liu H,Zeng Z,et al.Pharmacokinetics of ligustrazine ethosome patch in rats and anti-myocardial ischemia and anti-ischemic reperfusion injury effect[J].Int J Nanomed,2011,34(6):1391-1398.

[15]陈英.川芎嗪治疗外伤性脑损伤的时间窗及疗效观察[J].山东医药,2012,52(21):95-96.

Study on the protection effect of ligustrazine on brain injury in rats

XING Shu-fang1,WANG Lin2

(1.Department of Neurosurgery,First People′s Hospital of Wu′an City,Wu′an 056300,China;2.Fengnan District Hospital of Tangshan,Tangshan 063300,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effect of ligustrazine on brain injury in rats.MethodsSixty rats were selected and randomly divided into control group (n=20),injury group (n=20) and treatment group (n=20).Feeney brain injury model was made in injury group and treatment group.Rats in treatment group were given ligustrazine after injury.The effect of brain injury on morphology and learning function of rats and the protection effect of ligustrazine were evaluated by HE staining,electron microscope and morris water maze.ResultsHE staining results showed that the number of normal motor neuron in treatment group was more than that of injury group.The electron microscope results showed that the pycnosis of nerve cells,the staining of chromatin and the vacuolization of hyalomitome were lighter in treatment group than those in injury group.The results of morris water maze showed that the time of first arriving safe plat (s) in treatment group was less than that of injury group (7.68±1.09 vs.10.15±2.35),the time of swimming in target quadrant (s) (86.14±16.68 vs.62.38±19.67) and the number of arriving safe plat (6.4±2.3 vs.3.8±1.6) in treatment group were greater than those of injury group,there being significant differences (P<0.05).ConclusionLigustrazine may play an important role in the brain injury and learning function in rats.

Key words：Brain injury;Ligustrazine;Morris water maze

收稿日期：2015-09-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605005