高效液相色谱法测定肾复康胶囊中丹酚酸B的含量

黎春彤，何世荣，刘皈阳*，李　翔，冯春景

高效液相色谱法测定肾复康胶囊中丹酚酸B的含量

黎春彤1，何世荣2，刘皈阳1*，李翔1，冯春景1

[摘要]目的采用高效液相色谱法测定肾复康胶囊中丹酚酸B的含量。方法采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-0.2% 磷酸溶液(24∶76)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为286 nm，柱温为25 ℃，进样量10 μL，运行时间为20 min。结果丹酚酸B在5.00～100 μg/mL范围线性关系良好，r=0.999 6(n=6)，平均回收率为100.3%，RSD=0.85%。结论本方法简便、准确，灵敏度高，重现性良好，可用于肾复康胶囊中丹酚酸B的质量控制。

[关键词]肾复康胶囊；高效液相色谱法；丹酚酸B

0引言

肾复康胶囊为沈阳军区联勤部门诊部军队非标准制剂，由当归、黄芪、全蝎、丹参、大黄、山药、山茱萸、何首乌、杜仲、猪苓、肉苁蓉、川牛膝、芡实、川芎共14味药材组成，具有滋补脾肾、行气活血、温阳利水等功效，主要用于肾炎、蛋白尿、肾病综合征、尿毒症等症，其中丹参具有活血化瘀、保肝消痛等功效，药理研究表明，其主要活性成分丹酚酸B有明确的抗氧化作用，对心血管系统、肝脏、肾脏和肺均具有保护作用[1-4]。目前其质量标准中仅对其中阿魏酸进行含量测定。为了更好地控制产品质量，完善和提高质量标准，本研究对该制剂中丹参药材所含丹酚酸B的含量进行测定，为有效控制该制剂的质量提供了简便、快捷、结果准确、重复性好、实用性强的方法。

1仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent 1200系列四元泵，VWD检测器，PuXiang MODEL 320柱温箱，Agilent 1200 色谱工作站；梅特勒-托利多AE200电子天平；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111562-201313，纯度：97%)。乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。肾复康胶囊及阴性对照均为中国人民解放军沈阳军区联勤部门诊部制备(规格：0.33 g/粒，100粒/瓶，批号：20140103、20140601、20150101)。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(24∶76)；柱温：25 ℃；检测波长：286 nm；进样量：10 μL，运行时间：20 min。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液制备精密称定在60 ℃减压干燥4 h的丹酚酸B对照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，制成每1 mL含100 μg丹酚酸B的对照品储备液。

2.2.2供试品溶液制备精密称量同一批号肾复康胶囊1.0 g，置25 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，称定重量，超声处理25 min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液制备按照肾复康胶囊的处方比例和制法，制备缺丹参的阴性对照样品，按照“2.2.2”项下方法制备成阴性对照溶液。

2.3系统适应性试验分别取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，在上述色谱条件下，各进样10 μL，测得HPLC图谱(图1)，理论塔板数按丹酚酸B计算不低于2 500。

图1　对照品(A)、供试品(B)、阴性对照(C)的HPLC图

2.4线性关系的考察精密吸取丹酚酸B对照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀。上述溶液依次进样，进样量10 μL，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标、丹酚酸B浓度(X)为横坐标进行线性回归，丹酚酸B在5.00～100 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，回归方程：Y=13.725 X-11.361，r=0.999 6(n=6)。

2.5精密度试验精密吸取上述对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录丹酚酸B峰面积，其RSD为1.13%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验精密称取同一批次供试品(批号：20140103)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录峰面积，测得丹酚酸B的平均含量为0.946 mg/g，RSD为1.08%。

2.7稳定性试验精密吸取上述同一供试品溶液(批号：20140103)，分别在0、2、4、8、10、12 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录峰面积，其RSD为0.78%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8加样回收率试验分别精密称取0.25 g含0.946 mg/g丹酚酸B的肾复康胶囊内容物6份，分别加入对照品储备液5 mL，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，测定丹酚酸B的含量，计算得丹酚酸B平均加样回收率为100.3%，RSD为0.85%。结果见表1。

2.9样品测定分别取3批供试品各3份，按“2.2.3”项下方法，制备供试品溶液，按“2.2.1”项方法进样10 μL，记录峰面积并计算3批丹酚酸B的含量，结果见表2。

表1　加样回收率试验结果

表2　样品测定结果

3讨论

3.1提取溶剂的选择由于丹酚酸B的稳定性差，经过反复试验发现，供试品溶液提取效率稳定性差。为解决此问题，本试验对供试品的提取条件进行了多因素考察[5-7]。首先分别对比甲醇、乙醇和乙腈3种溶剂对丹酚酸B的提取效果和效率，发现甲醇和乙醇的提取效率优于乙腈，而乙醇提取液中提取出的物质种类更多，对丹酚酸B的干扰更多，因此最终选择了甲醇作为提取溶剂。

进一步对甲醇的比例进行考察，分别采用50%、75%、95%、100%的甲醇提取供试品，结果显示，75%的甲醇提取效果、效率明显高于其他3个比例，50%甲醇提取的杂质成分最多，95%甲醇提取效率最低。因此最终选择了75%的甲醇作为提取溶剂。

由于丹酚酸B的稳定性差，不宜采用加热的方式提取，因此选择超声提取的方法，而超声时间对供试品温度影响较大，因此本试验考察了5、15、25、35 min 4个时间长度，最终发现提取5、15 min不能使丹酚酸B完全提取，而提取35 min由于水温升高，丹酚酸B提取率反而降低，因此最终确定25 min为最优提取时间。

3.2色谱柱的选择丹酚酸B在非酸性的流动相中易解离，峰拖尾且测定含量偏低不准确，因此在药典和多篇文献中均采用不同的酸性流动相，如：甲醇-乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%磷酸等[7-9]。本试验中采用了乙腈-0.2%磷酸的流动相，并在此条件下，筛选了Eclipse XDB-C18、Zorbax XDB-C18、Zorbax SB-C183种不同填料的色谱柱，结果发现三者差别不大，考虑到酸性的流动相，最终选用耐酸性的Zorbax SB-C18色谱柱。

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Determination of salvianolic acid B in shenfukang capsule by HPLC

LI Chun-tong1,HE Shi-rong2,LIU Gui-yang1*,LI Xiang1,FENG Chun-jing1

(1.Department of Pharmacy,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China;2.Clinic of Joint-Logistics Department of Shenyang Command,Shenyang 110005,China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the content of salvianolic acid B in shenfukang capsule by HPLC.MethodsAn Agilent Zorbax Eclipse SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) column was used.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.2% phosphoric acid (24∶76).The flow rate was 1.0 mL/min.The detection wavelength was 286 nm.The column temperature was 25 ℃.The injection volume was 10 μL.The running time was 20 min.ResultsThere was good linear relationship between the area and the content of salvianolic acid B within the range of 5.00～100 μg/mL (r=0.999 3),and the average recovery rate was 99.98% with RSD=1.32%.ConclusionThe method is simple and accurate,and it can be used for the quality control of salvianolic acid B in shenfukang capsule.

Key words：Shenfukang capsule;HPLC;Salvianolic acid B