通腑化瘀汤对术后肠梗阻大鼠肠组织COX-2及Cajal间质细胞表达的影响

张宝刚，陈苏宁，梁靓靓，于　飞

·论著·

通腑化瘀汤对术后肠梗阻大鼠肠组织COX-2及Cajal间质细胞表达的影响

张宝刚，陈苏宁*，梁靓靓，于飞

中国医科大学附属盛京医院中医科，沈阳 110004

[摘要]目的建立术后肠梗阻大鼠模型，观察通腑化瘀汤对术后肠梗阻大鼠肠组织环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)及Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)表达的影响，评估肠粘膜损伤程度，为临床更好地防治术后肠梗阻提供有效的治疗方剂和理论依据。方法取健康雄性SD大鼠45只，随机分为通腑化瘀汤组(药物组)、生理盐水对照组(对照组)、空白组，药物组和对照组给予开腹手术建立术后肠梗阻模型，手术后6、16 h时间点分别给予通腑化瘀汤药液和生理盐水各0.8 mL灌胃，空白组不给予手术处理。处死前取大鼠小肠远端距盲肠约5 cm的肠组织，采用HE染色显微镜下观察肠粘膜损伤情况；免疫组织化学方法检测c-kit蛋白(ICC特异性标志物)和COX-2蛋白的平均光密度值。结果对照组与空白组相比，COX-2表达显著提高(P<0.05)，c-kit表达显著降低(P<0.05)，肠黏膜损伤程度较重；药物组与对照组相比，COX-2表达显著降低(P<0.05)，c-kit表达显著提高(P<0.05)，损伤的肠粘膜得到一定程度修复。结论通腑化瘀汤能够减少术后肠梗阻小肠组织COX-2的表达，改善ICC形态并提高ICC数量，抑制炎症反应，对受损伤的肠粘膜起到保护作用。

[关键词]通腑化瘀汤；术后肠梗阻；COX-2；Cajal间质细胞

0引言

术后肠梗阻(Postoperative ileus，POI)是由于腹部或非腹部手术而造成的，是手术创伤打击后不可避免的胃肠动力障碍性疾病[1]，临床上多表现为恶心、呕吐、腹痛、腹胀、肠鸣音消失以及排气排便延迟等一系列症状。腹部术后肠梗阻的处理是临床最棘手的难题之一，是腹部手术后常见的并发症。术后肠梗阻不仅延缓了患者术后康复速度，而且给患者的身心、家庭及经济均造成了较为沉重的负担。

COX-2是一种促炎因子，COX-2的过度表达加剧炎症反应和组织损伤，对肠道平滑肌产生抑制作用，减弱消化道运动功能[2]。ICC是胃肠道的起搏细胞，位于胃肠道的许多区域，在胃肠运动调控中起着重要作用[3-5]。很多胃肠运动功能障碍性疾病如肠梗阻、糖尿病胃轻瘫、慢性传输性便秘等，均存在ICC数量和功能的异常改变[6-8]。然而在POI中，ICC是否存在异常变化的报道较少。本研究以健康SD大鼠建立术后肠梗阻模型，观察通腑化瘀汤对术后肠梗阻大鼠肠组织胃肠道起搏细胞ICC及促炎因子COX-2表达的影响，更好地为POI的预防及治疗提供有效手段。

1材料与方法

1.1动物SD大鼠45只，均为雄性，体重(200±20)g，中国医科大学附属盛京医院动物实验室提供，实验动物使用许可证编号：SYXK(辽)2010-0098。由中国医科大学附属盛京医院实验动物管理中心饲养。

1.2药品与试剂通腑化瘀汤(组方：生大黄15 g、枳实10 g、厚朴10 g、黄芪20 g、丹参15 g、炙甘草6 g)由中国医科大学附属盛京医院中药局提供，用温开水将其完全溶解，制成浓度为1 g/mL的药液。兔抗大鼠COX-2抗体和兔抗大鼠c-kit抗体均购自博奥森公司，免疫组化检测试剂盒购自福州迈新公司，DAB试剂盒购自北京中杉公司。

1.3动物分组、模型的建立、给药与取材将健康雄性SD大鼠45只随机分为通腑化瘀汤药物组(药物组)、生理盐水对照组(对照组)、空白组，每组15只。按照中国医科大学附属盛京医院实验室动物房标准进行分笼常规饲养1周，温度控制在25 ℃，湿度控制在50%。给予药物组和对照组共30只大鼠行腹部手术，具体方法如下：①大鼠手术前禁食24 h，可饮水。②5%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔内注射麻醉。③麻醉后腹部备皮，碘伏消毒，温生理盐水浸湿的纱布中间开一长约2～3 cm的开口铺在下腹部正中；无菌条件下于下腹部正中线做一个长约2 cm的切口，依次切开皮肤、腹壁肌肉后进腹，暴露腹腔。④用生理盐水湿棉签在腹腔内找到回盲部，轻轻移出盲肠及全部小肠外置于湿纱布之上；用生理盐水湿棉球由回盲部小肠末端自下而上擦拭全部小肠肠管，力度均匀，时间20 min，注意防止损伤肠系膜血管以保护肠管勿缺血坏死。⑤然后用生理盐水湿棉签按顺序将全部肠管放回腹腔，注意防止小肠扭转。⑥用手术缝合线连续缝合腹膜肌肉、间断缝合皮肤，关腹。⑦术后将大鼠置于暖灯下恢复2 h，麻醉清醒后禁食不禁水。⑧手术后24 h重新开腹切取远端小肠(距离盲肠5 cm处)全层标本长约1.0 cm，剔去肠脂垂，PBS洗净肠内容物，分别置于4%多聚甲醛和-80 ℃冰箱保存。通腑化瘀汤药物组:腹部手术后6、16 h，均给予大鼠通腑化瘀汤0.8 mL灌胃(根据等效剂量比值表计算60 kg成人76 g/d药物，即1.267 g/(kg·d)，等效换算至大鼠为7.92 g/(kg·d)，200 g大鼠为1.58 g/d即1.58 mL/d。生理盐水对照组：腹部手术后6、16 h均给予生理盐水0.8 mL灌胃。空白组：不行手术，但与手术组一同禁食24 h，不禁水。

1.4免疫组织化学染色及HE染色步骤取出放在多聚甲醛中固定72 h的小肠组织，切成2～3 mm小块，按常规方法制作组织切片。免疫组织化学染色：①脱蜡：将待用切片置入恒温箱，烘烤切片1 h，取出切片后，迅速放入二甲苯溶液中，浸泡脱蜡2次，每次20 min。②梯度水化：脱蜡后将切片依次放入100%无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇下行浸泡，然后PBS缓冲液冲洗5 min。③抗原修复：将切片放入柠檬酸缓冲液中，放入微波炉中高火5 min闷10 min，再加热1 min闷10 min，冷却至室温，PBS冲洗5 min。④封闭内源性过氧化物酶：滴加3%过氧化物酶阻断剂，室温下孵育20 min，然后PBS缓冲液冲洗，3×5 min。⑤封闭非特异性抗原：滴加山羊血清，室温下孵育20 min。⑥一抗孵育：滴加适当比例的一抗(COX-2的抗体浓度为1∶200，c-kit的抗体浓度为1∶100)，4 ℃冰箱过夜。第2天PBS缓冲液冲洗，3×5 min。⑦二抗孵育：滴加生物素化的二抗，室温下孵育20 min，PBS缓冲液冲洗，3×5 min。⑧S-P溶液孵育：滴加S-P溶液(链霉素抗生物素-过氧化物酶),室温下孵育20 min，PBS缓冲液冲洗，3×5 min。⑨显色：滴加DAB显色溶液(1 mL+1滴显色剂)，在室温下控制背景程度，显色约1～3 min，待出现阳性时流水终止。⑩复染、脱水封片：苏木素复染2 min，流水返蓝10 min。然后上行梯度酒精(30%、70%、100%)脱水，二甲苯脱酒精，中性树胶封片。HE染色：①脱蜡：二甲苯10 min→二甲苯10 min→100%酒精10 min→95%酒精10 min→85%酒精10 min→水洗；②苏木素10 min→水洗直流水冲洗20 min；③伊红1 min→水洗片刻；④脱水→透明→封片。

1.5判定标准免疫组化染色结果判定：显微镜下观察切片的显色反应，c-kit免疫组化染色以胞膜、胞质出现棕黄色或褐色为阳性表达，主要分布于粘膜下层、肌层；COX-2以胞质、核膜着色为主，主要分布于粘膜层及粘膜下层。400×视野下随机选5个视野，应用ImagePro-Plus专业图形分析系统，计算c-kit、COX-2的平均光密度值，其包含表达面积和表达浓度信息，在选定的面积一定时，平均光密度值越大，表示c-kit、COX-2的表达越强，可代表其相对表达量。肠黏膜损伤程度观察：在光镜下观察三组肠粘膜组织肠绒毛排列是否整齐，有无变短脱落及融合成片；各层组织是否存在炎性细胞浸润。

2结果

2.1各实验组大鼠术后24 h小肠组织COX-2、c-kit的表达水平免疫组织化学染色结果显示：空白组小肠组织上COX-2未见明显表达，或可见少量表达，散在分布；对照组表达强烈，颜色呈黄褐色，着色较深，分布密集，广泛分布于粘膜及粘膜下层，肌层也可见表达，平均光密度高于空白组(P<0.05)；药物组COX-2表达较对照组明显减少，与对照组相比着色较浅，平均光密度值低于对照组(P<0.05)。小肠组织ICC特异性蛋白c-kit空白组表达强烈，颜色呈黄褐色，着色较深，主要分布于粘膜下层和浆膜层；对照组表达偏弱且可见阳性细胞减少，着色偏淡，分布稀疏，甚至缺如，平均光密度显著低于空白组(P<0.05)；药物组尚可见着色较深的c-kit阳性表达，与对照组相比，药物组平均光密度值增加(P<0.05)。见表1、图1～图2。

表1　各组大鼠术后24 h小肠组织COX-2、c-kit平均光密度比较

注：*与空白组比较，P<0.05；#与对照组比较，P<0.05

图1　各组大鼠小肠组织COX-2表达(400×)

图2　各组大鼠小肠组织c-kit表达(400×)

2.2各实验组小肠粘膜组织病理染色观察空白组肠粘膜上皮排列有序，绒毛结构清晰，组织结构正常，未见损伤；对照组肠粘膜绒毛排列不整齐，大部分绒毛高矮不一、变短、间距增宽、上皮脱落、间质充血水肿，部分可见绒毛融合成片，炎症细胞浸润；药物组与对照组相比，肠粘膜绒毛有明显改善，排列稍显不齐，粗细基本相等，无粘连成片现象，绒毛间质充血、水肿较对照组有所好转，炎性细胞浸润现象明显改善。见图3。

图3　各组大鼠肠粘膜组织(HE×100)

3讨论

术后肠梗阻发生因素众多，现代医学认为其发生机制可能与术后神经反射对胃肠道动力的抑制，手术操作刺激中性粒细胞释放大量的炎症因子和多种麻醉剂对肠道蠕动的抑制等因素相关[1]。其中，手术触发肠道炎症介质的释放被认为是POI发生的关键因素，对胃肠动力影响较大，是临床预防和治疗的重点和难点。

COX-2是一种诱导型环氧酶糖蛋白，是催化花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)和血栓素的限速酶，是炎症反应的中心环节，通常情况下在组织细胞中几乎不表达。当受到刺激时，机体中的单核巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等产生大量的COX-2[9]。诱导型COX-2催化AA氧化生成一系列PG[10]。PG可产生氧自由基和活性氧，其主要生理功能PGE2能诱发炎症反应，促进局部血管扩张，毛细血管通透性增加，引起红、肿、热、痛等症状，造成肠粘膜炎症、组织破坏及溃疡形成。ICC位于人类消化道许多区域，c-kit为ICC特异性表达蛋白。然而在POI时，肠壁内的ICC发生了怎样的改变，迄今其病理机制仍未十分明确。其可能机制是POI患者胃肠道肌层的白细胞聚集和巨噬细胞激活将iNOS表达上调，进而产生过量的NO。后者是重要的肠神经抑制性递质[11]，其作用的主要靶向分子是鸟苷酸环化酶(Soluble guanylate cyclase，sGC)，NO与sGC结合后催化生成环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine3′,5′-monophospate，cGMP)，一种催化鸟苷三磷酸(Guanosine triphosphate，GTP)转变为cGMP的酶。cGMP作为细胞内重要的第二信使，激活cGMP依赖蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinases，PKG)，激活后的PKG磷酸化目标蛋白，包括离子通道、离子泵和参与调控胞内Ca2+水平的酶，从而降低胃肠道平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMC)内Ca2+浓度，抑制SMC兴奋，导致胃肠平滑肌松弛效应。Lino等用免疫荧光双标染色发现整个胃肠道肌层内ICC细胞几乎都呈sGC阳性，免疫电镜观察也进一步证实sGC阳性细胞具有ICC的超微结构特征。相关研究显示，应用外源性NO的供体后，小鼠小肠ICC的起搏节律和幅度均降低，而应用鸟苷酸环化酶抑制剂或ATP敏感性钾离子通道阻滞剂后，可以阻断外源性NO供体引起的ICC电流的降低[12]，NO发挥抑制性作用的主要靶细胞是ICC。

肠梗阻属中医“肠结病”，“关格”的范畴，祖国医学认为，气滞血瘀即可造成腹气不通，不通则痛，继而出现“痛，呕，胀，闭”四大症状[13]。其病机往往因术后机体正气耗伤，气虚推动无力，致脾胃升降功能失调，腑气不通，气滞血瘀，肠道燥屎内结而发生本病。通腑化瘀汤由大黄、厚朴、枳实、黄芪、丹参、炙甘草六味中药组成，是在《伤寒论》小承气汤基础上化裁而成。方中大黄泻下攻积、活血祛瘀为君药；厚朴、枳实为臣药，厚朴下气除满、枳实行气消痞，合而用之，即能消痞除满，又能使胃肠气机通降下行以助泻下通便；佐以黄芪、丹参，可益气健脾、托毒生肌，并增活血祛瘀之功；炙甘草缓急止痛、益气补中、调和诸药为使药，六药合用具有通腑泻浊，活血化瘀之功。本方君、臣、佐、使配伍得当，补气健脾与泻下攻积药同用，避免了攻邪则正气不支、补正则邪实愈壅的缺陷，起到攻补兼施的作用。本次实验中，免疫组化结果显示：药物组COX-2蛋白的表达较对照组显著减少，ICC数量增加，其形态得到一定程度的修复，病理染色显示药物组小肠组织肠粘膜损伤明显减轻。其机制可能为通腑化瘀汤抑制腹腔肥大细胞及肠道巨噬细胞分泌促炎介质，减少白细胞代谢产物的产生，抑制胃肠道平滑肌的Ca2+内流，减轻胃肠道ICC的损伤。通过改善肠道及局部脏器的血液循环，增加局部组织供氧，促进炎性渗出物的吸收，进而保护肠粘膜，增加胃肠收缩，促进胃肠动力的恢复。本方还可增强机体免疫力，调节身体的整体机能，促进术后身体的康复。

本实验通过病理染色和免疫组织化学方法初步证明了通腑化瘀汤确实能够减轻术后肠道炎症反应，保护肠道粘膜以及促进肠道动力恢复。为本方今后在临床上的应用及进一步研究提供了依据。

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Effect of Tongfu Huayu decoction on expression of COX-2 and interstitial cells of Cajal in postoperative ileus rats

ZHANG Bao-gang,CHEN Su-ning*,LIANG Jing-jing,YU Fei

(Department of Traditional Chinese Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo provide effective prescriptions and theoretical basis for better prevention and treatment of postoperative ileus in the clinic,establish the model of the postoperative ileus rats,then observe the expression of the cyclooxygenase-2 (COX-2) and interstitial cells of Cajal (ICC) in the small intestine tissue of the postoperative ileus rats under the intervention of the Tongfu Huayu decoction,and assess the degree of the intestinal mucosa injury.MethodsForty-five healthy male SD rats were divided into 3 groups at random:group of Tongfu Huayu decoction (drug group),group of normal saline(control group) and blank group.The bellies of rats in the first two groups were operated to establish the model of the postoperative ileus.After 6 h and 16 h,the Tongfu Huayu decoction and normal saline of 0.8 mL was respectively lavaged,while the blank group was not processed.The distal small intestine tissue of the rats about 5 cm away from the cecum was cut off before executing.HE method was used to observe the situation of the intestinal mucosa injury under the microscope;the average optical density value of the COX-2 and the c-kit which was the specific marker of the interstitial cells of Cajal was tested by immunohistochemistry.ResultsThe expression of the COX-2 in control group improved significantly compared with blank group (P<0.05),the expression of the c-kit was lower (P<0.05),and the degree of the intestinal mucosa injury was severer;the expression of the COX-2 in drug group decreased significantly compared with control group (P<0.05),the expression of the c-kit was higher (P<0.05),and to some extent,the intestinal mucosa injury was repaired.ConclusionTongfu Huayu decoction can decrease the expression of the COX-2,improve the morphology of interstitial cells of Cajal and increase the number of interstitial cells of Cajal,and inhibit the inflammation,thus playing an important role in preventing the intestinal mucosa.

Key words：Tongfu Huayu decoction;Postoperative ileus;COX-2;Interstitial cell of Cajal

收稿日期：2016-02-23

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605001