一株生物转化白头翁皂苷真菌的筛选与鉴定

周　成，时维静，肖　新，谢　越，汪建飞，马忠友，*(1.安徽科技学院　应用微生物研究所，安徽　凤阳　100;.安徽科技学院　农业部生物有机肥创制重点实验室，安徽　凤阳　100;.安徽科技学院　食品药品学院，安徽　凤阳　100)



一株生物转化白头翁皂苷真菌的筛选与鉴定

周成1，2，时维静3，肖新2，谢越2，汪建飞2，马忠友1，2，*
(1.安徽科技学院应用微生物研究所，安徽凤阳233100;
2.安徽科技学院农业部生物有机肥创制重点实验室，安徽凤阳233100;
3.安徽科技学院食品药品学院，安徽凤阳233100)

摘要:目的:筛选能够转化白头翁皂苷的真菌，并对该菌株进行分类鉴定。方法:将白头翁皂苷加入培养基中诱导真菌分泌白头翁皂苷糖苷酶，并通过薄层层析技术检测转化产物。再采用经典的形态学特征观察和现代的ITS－rDNA测序分子生物学分类技术相结合对真菌进行鉴定。结果:筛选出能够生物转化白头翁皂苷的RCEF4894菌株，该菌株被鉴定为棘孢曲霉Aspergillus aculeatus Iizuka。结论:棘孢曲霉RCEF4894菌株能够被诱导产生白头翁皂苷糖苷酶，将多糖基的白头翁皂苷水解成低糖基的皂苷。

关键词:白头翁皂苷;生物转化;棘孢曲霉

中药中活性成分或活性核心物质，是在肠道菌群及体内酶的作用下产生的一系列代谢产物，天然中药中不存在或含量很低。生物转化不仅能改变中药中主要成分的含量、活性物质的结构，扩大药源范围，亦能对有毒中药进行持效减毒，增效扩用。通过改造皂苷类物质的糖基从而提高该类物质的活性的研究已有相关的文献报道，其中人参皂苷被生物转化为皂苷元后，抗肿瘤药效明显提高［1］。

白头翁(Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel)为毛莨科植物，它的干燥根作为中药，其性寒，味苦，具有清热解毒，凉血止痢，燥湿杀虫的功效。临床上主要用于治疗细菌性痢疾，阿米巴痢疾，妇科阴道炎，湿热泻痢，温疟寒热，腹痛，下痢浓血等症。研究表明白头翁除具有抗菌和抗病原虫的作用外，还具有抗癌，杀精，治疗内毒素血症等作用［2］。本实验旨在探索以白头翁皂苷为诱导物，筛选出能够生物转化白头翁皂苷的棘孢曲霉Aspergillus aculeatusIizuka RCEF4894菌株，该菌株能够产生白头翁皂苷糖苷酶并将多糖基的白头翁皂苷转变成低糖基的皂苷;为进一步开发利用白头翁提供一定的理论和技术基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种毛霉(Mucor)菌株BFKC03、根霉(Rhizopus)菌株BFKC07、曲霉(Aspergillus)菌株RCEF4894等真菌菌株均由安徽科技学院生物技术教研室吴萍教授惠赠;

1.1.2培养基及其配制基础培养基:称取KH2PO42.0 g、(NH4)2SO48.0 g、CO(NH2)20.3 g、MgSO4.7H2O 3 g、CaCl20.3 g、MnSO40.00156 g、CoCl20.002 g、FeSO4.7H2O 0.005 g、ZnSO4.7H2O 0.0014 g，用蒸馏水定容至1000 mL，115℃灭菌30 min。

马铃薯培养基:马铃薯200 g、蔗糖(葡萄糖) 20 g、琼脂15～20 g、水1000 mL、pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000 mL，121℃灭菌30 min。

CYA固体培养基: K2HPO41.0 g、查氏浓贮液10 ml、酵母膏5 g、蔗糖30 g、琼脂15 g、水1000 mL; pH 为6.0，121℃灭菌15 min。

查氏浓贮液: NaNO330 g、KCL 6 g、MgSO4·7H2O 5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、蒸馏水1000 mL。

CA固体培养基: K2HPO41.0 g、NaNO33.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15 g、水1000 mL; pH为6.0，121℃灭菌15 min。

1.1.3主要试剂白头翁生药(根)，购于亳州市沪谯中药饮片厂，经时维静教授鉴定为正品;高效硅胶G板，购于青岛海洋化工厂; TaqDNA聚合酶、dNTP、胶纯化回收试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0均购自大连宝生物公司(TaKaRa) ;平衡酚(pH8.0)购于上海生工;其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1白头翁皂苷的提取用蒸馏法从白头翁根中提取得到原白头翁素，用乙醇提取纯化后，浓缩干燥得到白头翁总皂苷［3］。

1.2.2转化白头翁皂苷真菌的筛选将毛霉(Mucor)菌株BFKC03、根霉(Rhizopus)菌株BFKC07、曲霉(Aspergillus)菌株BFKC23等真菌菌株分别接种于马铃薯培养基上，28℃活化培养2～3 d。于250 mL三角烧瓶中分别装基础培养基100 mL，再向瓶中加入葡萄糖2 g，混匀，灭菌。接入活化好的菌种于28℃摇床培养(转速200rpm) 1～2 d，再向其中加入无菌白头翁皂苷溶液至终浓度为0.5%，在28℃条件下继续诱导培养2～3 d。

菌种培养好后将发酵液用真空泵抽滤，菌体－80℃保存备用，收集上清液。搅拌上清液加入乙醇达75%(v/v)，4℃保存过夜。离心取上清液，用真空旋转蒸发仪30℃浓缩。浓缩液冷冻干燥得干粉，然后用甲醇溶解30 min，离心最后得到上清液用于硅胶板薄层检测。

1.2.3白头翁皂苷的薄层层析检测将硅胶板在110℃烘箱中活化30～60 min，用微量毛细管吸取白头翁皂苷及样品点样于硅胶板上。每次的点样量为毛细管长度的2 cm左右;点样三次，每次点样后均需用电吹风吹干。将点好样品的硅胶板放入层析缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距硅胶板底边0.5～1.0 cm，密封盖，待展开至规定距离(一般为5～6 cm)后，取出吹干溶剂，用碘显色。所用展开剂为V(氯仿) ∶V(甲醇)∶V(双蒸水) =50∶38∶2，显色剂为碘蒸气显色。

1.2.4菌株形态特征的观察与测定:固体平板培养法:把菌株依次接种到CYA和CA，平板培养基上时，随着菌落的生长，观察了菌株培养3 d至7 d时的形态学特征，包括宏观特征(菌落大小、菌落颜色、生长速度、基部菌丝体、褶皱和沟纹等)和微观特征(细胞形态，孢子大小，孢子形态等)［4］。

胶带显微观察法:先取一洁净的载玻片，用胶头滴管在载玻片中央滴一滴蒸馏水，用剪刀剪下一段长约5 mm的透明胶带，在无菌条件下打开培养皿盖，用胶带粘性一面在菌落上轻轻地粘一下，将胶带放在载玻片水滴上，在胶带上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝进行染色，再用盖玻片盖上，用吸水纸吸去多余水分。然后放在显微镜下镜检，记录观察结果。

1.2.5菌株ITS－rDNA区域的扩增采用氯化苄法提取基因组DNA［5］，ITS－rDNA序列扩增采用真菌鉴定通用引物ITS4(5' " TCCTCCGCTTATTGATATGC " 3')和ITS5(5' " GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG " 3')，引物由上海生工生物工程有限公司合成。扩增程序: 94℃变性5 min，(94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min)×30，72℃延伸10 min，4℃保温。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯化后送上海Invitrogen生物技术有限公司进行序列测定［6］。

1.2.6分子分类系统树的构建为研究供试菌株与相关真菌的亲缘关系及其系统地位，用该菌株的ITS －rDNA序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLAST search)，下载部分相关菌株的ITS区域序列与供试菌株的序列放在一起，用BioEdit软件进行匹配排列。使用MEGA4.1软件，并采用Neighbor－Joining和Bootstrap analysis方法进行1000次重复抽样分析和分支系统树的构建［6］。

2　结果与分析

2.1转化白头翁皂苷真菌的筛选

毛霉(Mucor)菌株BFKC03、根霉(Rhizopus)菌株BFKC07、曲霉(Aspergillus)菌株RCEF4894在含有白头翁皂苷的液体发酵培养基中诱导培养后，经硅胶板薄层检测发现RCEF4894菌株的培养液中产生与白头翁皂苷标准品迁移率相差很大的斑点(图1)，既有迁移率大的，也有迁移率小的斑点，判定该菌株能够对白头翁皂苷进行生物转化。然而，其它菌株的培养液中却产生与白头翁皂苷标准品迁移率相似的斑点，表明这些菌株没有转化白头翁皂苷的能力。

图1　白头翁皂苷转化产物的硅胶板薄层分析:1，白头翁皂苷; 2，曲霉菌株RCEF4894; 3，毛霉菌株BFKC03; 4，根霉菌株BFKC07Fig.1 Analysis of transformed products of Pulsatilla saponin using TLC silica gel plate: 1.Pulsatilla saponin; 2.Aspergillus strain RCEF4894; 3.Mucor strain BFKC03; 4.Rhizopus strain BFKC03

2.2转化白头翁皂苷真菌的分类鉴定

2.2.1真菌的形态特征RCEF4894菌株分别接种在CYA和CA固体平板培养基上，在28℃下进行培养，每隔12 d观察一次。RCEF4894在CYA上:绒状，正面褐色，反面淡黄色，有明显褶皱，有同心环，菌落7 d直径7.3～7.4cm;在CA上:绒状，正面黄褐色，反面淡黄色，布满培养基，有同心环。分生孢子头幼时为球形或辐射形(图2A)，直径100～230 μm，老时分裂成几个紧密的圆柱状结构，产孢结构单层(图2B)，孢子有显著的刺状突起(图2C)，椭圆形、球形、近球形，3.6～4.6×3.0～3.5 μm。这些形态特征与棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的描述性状相符合。

图2　曲霉RCEF4894菌株的形态特征: A.分生孢子头(40×) ; B.产孢结构(400×) ; C.分生孢子(400×)Fig.2 Morphological traits of Asperillus sp RCEF4894: A.conidial heads (40×) ; B.sterigmata in a single series (400×) ; C.conidia (400×)

2.2.2产白头翁皂苷糖苷酶真菌的ITS－rDNA序列分析:通过PCR技术从RCEF4894的DNA中扩增出了ITS－rDNA序列，测序结果显示整个ITS区共计487bp (图3)，其中ITS1为177bp、5.8S为156bp、ITS2 为154bp(GenBank No.HM140184)。

图3　曲霉菌株RCEF4894的ITS－rDNA序列Fig.3 ITS－rDNA sequence of Aspergillus aculeatus strain RCEF4894

图4　曲霉属部分菌株的ITS－rDNA序列分支系统树Fig.4 Neighbour－joining tree based on ITS region sequence data of some strains from Aspergillus spp

将测得的RCEF4894 ITS序列与GenBank数据库比对，和RCEF4894 ITS序列相似率达到99%的菌株均为棘孢曲霉Aspergillus aculeatus Iizuka。从构建的系统发育树(图4)也可以看出RCEF4894和棘孢曲霉Aspergillus aculeatus聚在一组，概率99%，和其他曲霉菌株相距甚远。综合比较该菌株的形态特征和ITS－rDNA序列结果，将RCEF4894菌株鉴定为棘孢曲霉Aspergillus aculeatus。

3　结论与讨论

对白头翁皂苷增强系统免疫和抗肿瘤的研究，是近年来研究的主要热点。钟邱等［7］分离白头翁的皂苷组分(正丁醇部分)有明显的体外抑瘤活性; Sun等［8］对白头翁皂苷进行溶血活性、急性毒性和免疫调节活性实验，结果显示白头翁皂苷(正丁醇部分)有弱的毒性;李文超等［3］也发现正丁醇部位抑菌效果最佳。白头翁皂苷B4主要在正丁醇部分，因此本实验选用正丁醇部分的白头翁皂苷提取物作为转化底物。

生物转化白头翁皂苷的实验研究也有相关报道［9－11］，杨宇等［11］对由犁头霉Absidia sp.800菌株产的白头翁皂苷糖苷酶进行了酶学性质的相关研究。本实验筛选出能够转化白头翁皂苷的RCEF4894菌株，采用经典的形态学特征观察和现代的ITS－rDNA区域测序分子生物学分类技术相结合，确定RCEF4894菌株在系统分类上属于棘孢曲霉，和杨宇等［11］实验所用的犁头霉Absidia sp.800菌株是不同的，为生物转化白头翁皂苷提供了一个新的途径。棘孢曲霉RCEF4894菌株白头翁皂苷糖苷酶的结构和性质，以及白头翁皂苷酶转化产物的化学结构和药效正在进一步研究中。

参考文献:

［1］宋学洲，高文斌，郑毅男，等.人参皂苷生物转化研究最新进展［J］.人参研究，2012，24(1) : 34－39.

［2］时维静，李立顺，董卫星.白头翁化学成分、药理作用及临床应用研究进展［J］.中兽医医药杂志，2009，28(4) : 22－25.

［3］李文超，时维静，顾有方，等.白头翁不同提取物抑菌作用研究［J］.中兽医医药杂志，2011，30(2) : 38－40.

［4］孔华忠.中国真菌志，第三十五卷:青霉属及其相关有性型属［M］.北京:科学出版社，2007: 1－284.

［5］肖明松，夏海武，鲍方印，等.大银鱼线粒体DNA细胞色素b序列的研究［J］.安徽科技学院学报，2014(5) : 24－28.

［6］马忠友，程飞，邱亮，等.一株产植酸酶酵母菌株的分类鉴定与诱变育种［J］.食品与发酵工业，2011，37(4) : 21－25.

［7］钟邱，倪琼珠.白头翁中皂苷成分对肿瘤细胞的抑制作用［J］.中药材，2004，27(8) : 604－605.

［8］SUN Yongxu，LIU Jicheng，YU Haitao，et al.Isolation and evaluation of immunological adjuvant activities of saponins from the Roots of Pulsatilla chinensis with less adverse reactions［J］.International Immunopharmacology，2010，10(5) : 584－590.

［9］王伟，唐正军，鱼红闪，等.白头翁皂苷酶解产物的分离纯化［J］.大连轻工业学院学报，2005，24(1) : 4－7.

［10］张小愚，王伟，刘琳，等.单糖基白头翁皂苷的分离纯化［J］.大连轻工业学院学报，2006，25(2) : 79－82.

［11］杨宇，王东明，金凤燮，等.白头翁皂苷糖苷酶的纯化及其酶学性质［J］.大连工业大学学报，2009，28(6) : 404－407.

(责任编辑:马世堂)

Isolation and Identification of the Biotransformed－Pulchinenoside Fungi

ZHOU Cheng1，2，SHI Wei－jing3，XIAO Xin2，XIE Yue2，WANG Jian－fei2，MA Zhong－you1，2，*
(1.Institute for Applied Microbiology，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China; 2.Key Laboratory of Bio－organic Fertilizer Creation of Ministry of Agriculture，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China;
3.College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)

Abstract:Objective: The fungi which could biotransform pulchinenoside were selected，and they were classified and identified.Methods: The pulchinenoside was supplemented into the culture medium to induce secretion of pulchinenoside－glycosidase by the fungi，and the pulchinenoside was detected by silica gel thin－layer chromatography.The fungi was identified based on its ITS－rDNA sequence and the morphological characteristics.Results: The RCEF4894 strain biotransformed pulchinenoside was isolated and identified as Aspergillus aculeatus Iizuka.Conclusion: The RCEF4894 strain could be induced to produce the pulchinenoside－glycosidase，which hydrolyzed the polyglycosylation of pulchinenoside into underglycosylation of pulchinenoside.

Key words:Pulchinenoside; Biotransform; Aspergillus aculeatus

中图分类号:R282

文献标识码:A

文章编号:1673－8772(2016) 02－0022－05

收稿日期:2016－01－10

基金项目:安徽省科技重大专项项目(15czz03102) ;安徽省自然科学基金(1608085MC59) ;国家星火计划(2015GA710013; 2015GA710014)。

作者简介:周成(1985－)，男，安徽省安庆市人，博士，讲师，主要从事农业微生物与植物互作研究。*通讯作者:马忠友，副教授，E－mail: mazy@ ahstu.edu.cn。