针刺对颈椎间盘退变大鼠颈椎软骨终板结构及交界面血管芽的影响

王　莹　彭　伟

(湖北医药学院附属太和医院门诊服务中心，湖北　十堰　442000)

针刺对颈椎间盘退变大鼠颈椎软骨终板结构及交界面血管芽的影响

王莹彭伟△

(湖北医药学院附属太和医院门诊服务中心，湖北十堰442000)

【摘要】目的观察针刺对颈椎间盘退变大鼠颈椎软骨终板结构及交界面血管芽的影响。方法将60只SD雄性大鼠随机分为3组，空白组、模型组及针刺组，每组各20只。除空白组外，模型组及针刺组均建立颈椎间盘退变模型。针刺组采用电针治疗，其余2组不做处理。治疗3个疗程后，处死全部大鼠，对大鼠进行组织学观察，并观察软骨终板钙化层、非钙化层厚度，以及交界面血管芽数量。结果模型组软骨终板交界面血管芽数量较空白组减少(P<0.01)，说明造模成功；针刺组软骨终板交界面血管芽数量较模型组增加(P<0.05)。模型组大鼠软骨终板钙化层厚度高于空白组(P<0.05)，非钙化层厚度低于空白组(P<0.05)，说明造模成功。针刺组大鼠软骨终板钙化层厚度低于模型组(P<0.05)，非钙化层厚度高于模型组(P<0.01)。结论针刺可延缓颈椎间盘退变大鼠颈椎软骨终板钙化，减轻软骨终板钙化程度，增加血管芽数量，提高髓核营养供应，起到缓解疼痛、延缓椎间盘退变的作用。

【关键词】颈椎；病理学；椎间盘；动物，实验；针刺；软骨细胞

随着现代社会生活节奏的加快，电脑、空调和汽车的广泛使用，低头工作方式人群增多，人们受风寒湿邪侵袭、屈颈及颈部外伤的可能性均大幅度增加，造成颈椎病的患病率不断上升，且发病年龄不断提前[1]。一旦患有颈椎病，往往缠绵难愈，症状呈多元化，影响颈部神经根、血管、脊髓，出现头晕、头痛、颈肩背痠痛、上肢放射痛、下肢无力等症状，特别是脊髓型颈椎病患者，轻则四肢痿废，重则发生瘫痪，不仅长期折磨患者本人，也给整个家庭、社会带来沉重的经济负担。颈椎病将成为与现代社会相伴随的一种常见病、多发病，在整个脊柱病的发病谱中，颈椎病已上升为主要位置。本实验主要研究针刺对颈椎间盘退变大鼠颈椎软骨终板结构及交界面血管芽的影响，以期为针刺治疗颈椎病提供一定的依据。

1动物与方法

1.1动物 选择3个月龄清洁级SD雄性大鼠60 只，体质量(300±20) g，由湖北医药学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：沪动合证字152号。动物实验环境等级：清洁级，环境设施合格证号：医动字第02-24号。正常饲养，温度为(23±2) ℃,湿度为(50±5) %，自由摄食饮水，每日光照12 h。

1.2方法

1.2.1选择分组将60只SD大鼠适应性喂养2周后，随机分为3组，空白组、模型组及针刺组，每组各20只，编号后分笼饲养。

1.2.2造模方法[1-2]除空白组外，模型组及针刺组大鼠均按0.1 g/ kg 体质量进行盐酸氯氨酮注射液麻醉，麻醉成功后，将大鼠俯卧位于手术台上，颈椎后方备皮，碘伏消毒，铺巾。取颈后部正中纵向切口(从寰枕关节至第1胸椎棘突处)，长约2.5～3 cm，切开皮肤后，逐层分离筋膜、肌肉，逐层分离筋膜、颈阔肌、颈斜方肌及颈菱形肌，钝性剥离两侧肌肉直至暴露深层肌群，横向切断颈夹肌，头、颈、寰最长肌，颈髂肋肌和头半棘肌，充分暴露颈椎，并切除1.2～1.5 cm 长一段，充分暴露颈椎后依次切除第2～7颈椎 (C2～7)棘上和棘间韧带，彻底止血后缝合两侧骶棘肌和皮肤。造模成功后，单笼标准饲料喂养，室温23～25 ℃。

1.2.3治疗方法针刺组采用电针治疗。选穴：天柱(双侧)、大椎、大杼(双侧)穴。操作：局部常规消毒，采用华佗牌32号0.5寸13 mm不锈钢毫针(苏州医疗用品厂有限公司)针刺1 cm，然后接青岛鑫升G6805-Ⅱ型电针仪(青岛鑫升实业有限公司)，疏密波，电流强度2 mA，每次电针时间25 min，每日1次，1周为1个疗程，连续治疗3个疗程。空白组、模型组均不做任何处理。

1.3标本采集及方法①治疗3个疗程后，处死全部大鼠，在4倍手术显微镜下沿上、下软骨终板与椎体的交界面切下C4～5椎间盘，用10%中性甲醛室温下固定24 h，10%EDT脱钙2周，脱钙处理后行苏木精-伊红(HE)染色，在光镜×10倍下观察颈椎间盘组织学变化。②采用Disector自动计数法和体视学分析法[3]，连续8 μm切片，各组20个标本，采用Mias系列病理图像分析系统[3]对采集图像进行分析，每张切片选择在100倍显微镜下观察软骨终板交界面血管芽数量。③测定每组20个椎间盘正中矢状面，关节软骨与髓核中心交界处软骨终板钙化层、非钙化层厚度，以潮标为分界线，由于潮标呈波浪形，取每个视野钙化层与非钙化层的最大值与最小值的平均值作为各层厚度。

2结果

2.1各组大鼠颈椎间盘组织学观察空白组：颈椎间盘基本显示正常结构，外周由规则排列的纤维环和中央大的髓核组成；软骨板分为生长软骨层和关节软骨层；关节软骨层由一薄层透明软骨组成，与继发性骨化中心相连接的透明软骨钙化，潮标清晰可见钙化的关节软骨极薄，钙化软骨与骨髓腔直接接触或与一薄层骨板相邻，钙化的软骨下分布有大量粗大血管(见图1)。模型组：颈椎间盘已开始退行性变化，纤维环板层结构紊乱，排列轻度不规则，部分髓核组织皱缩；关节软骨钙化层及非钙化层均增厚，潮标前移，关节软骨钙化厚度相当，软骨下骨板增厚，血管明显减少(见图2)。针刺组：颈椎间盘有退变，但较模型组形态稍微规则，纤维排列稍微整齐，髓核组织皱缩轻(见图3)。

图1空白组图2模型组图3针刺组

各组大鼠颈椎间盘组织学观察(HE，×10)

2.2各组大鼠软骨终板交界面血管芽数量比较见表1。

表1　各组大鼠软骨终板交界面血管芽数量比较　个，±s

与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

由表1可见，模型组软骨终板交界面血管芽数量较空白组减少(P<0.01)，说明造模成功；针刺组软骨终板交界面血管芽数量较模型组增加(P<0.05)。

2.3各组大鼠软骨终板钙化层、非钙化层厚度比较见表2。

表2　各组大鼠软骨终板钙化层、非钙化层厚度比较　±s

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01

由表2可见，模型组大鼠软骨终板钙化层厚度高于空白组(P<0.05)，非钙化层厚度低于空白组(P<0.05)，说明造模成功。针刺组大鼠软骨终板钙化层厚度低于模型组(P<0.05)，非钙化层厚度高于模型组(P<0.01)。

3讨论

椎间盘包括纤维环、髓核和软骨终板，它是一个完整的充有液体的弹性系统，有液压减震功能，幼年时含水量达80%以上，随年龄或退变增加，椎间盘渐萎缩而水分递减至60%～70%。颈椎间盘退变被认为是颈椎病发生和发展的根本原因，早期颈椎间盘退变可能是颈椎间盘突出的先决条件。日常生活中，颈椎间盘始终处于不同的肌肉收缩力和韧带张力作用下，各种应力可影响颈椎间盘的代谢。颈椎间盘的营养是通过椎体—软骨终板—椎间盘界面的通透作用，该通透作用的大小取决于软骨终板与椎体交界面血管的多少。椎体内血管的营养物质经软骨终板进入椎间盘，营养髓核和内层纤维环。髓核的营养供应依靠终板中区域血管的弥散作用，而且通过终板到髓核的营养通路取决于与软骨血管芽的直接接触联系。Roberts S等[3]对人类不同年龄椎体软骨终板下血管分布的研究显示，终板的中心区域血管粗而致密，分布较多，而周边部位则细而稀疏，分布较少。

吕刚等[4]通过灌注椎体终板血管铸型标本发现，终板血管在髓核区域分布密集，在内层纤维环区域分布稀疏，这一结果进一步证实了上述研究结论。Nerlich AG等[5]认为，软骨终板钙化、增厚将导致椎间盘有氧血液的供应减少，同时妨碍废物的排出，使乳酸浓度升高，pH降低，加速细胞凋亡或死亡，并形成恶性循环，导致椎间盘不断退变。Silberberg R[6]报道动物椎间盘突出可见到椎体干骺端软骨下骨质不规则，椎体骨小梁明显缺乏。Tolonen J等[7]认为，椎间盘退变的重要标志是软骨终板退变后导致血管侵入椎间盘。本研究进一步证实了上述结论，并发现中心与周边部位的血管分布差异在大鼠出生早期不甚明显，但随着大鼠生长发育，这种差别加剧，至发育成熟后则不再发生改变。血管芽的存在对软骨终板的渗透性十分重要，而血管芽形态学差异与不同部位软骨终板的渗透性高低密切相关。髓核营养主要来自终板中心区域的血管，除此之外，中央髓核很少再有其他的营养来源，若该营养通路发生障碍，将直接影响髓核的细胞代谢。

在机体生长发育和老化过程中,椎间盘中央部位细胞和基质最关键的变化是营养供应减少。椎间盘细胞的营养物质依赖纤维环外周和椎体内血管通过基质弥散供应。在生长过程中，椎间盘体积增大、机体老化过程中供应椎间盘周围的动脉数量减少、软骨终板逐渐钙化，这些改变妨碍了营养物质的供应和废物的排出[8]。生长发育阶段的椎间盘和椎体软骨生长需要大量营养供应，此时终板下的丰富血管分布是保证其快速生长发育的结构基础。生长停止后，椎间盘和软骨终板代谢相对稳定，终板下血管数目相应减少并趋于稳定。在不断退变过程中，终板下血管数目逐渐减少，血管结构功能的降低，随着椎体骨内压的明显升高，导致血管芽及血窦内血流动力学可能发生异常改变，出现静脉回流障碍、血液黏稠度增加等血液淤阻表现，并进而造成血管内皮细胞的损伤和血管栓塞。退变出现的终板下血管分布明显减少，既与其生长发育的逐渐停止有关，又与椎体骨内血液循环障碍形成的血液淤阻有关。这种变化的结果将是终板下血管分布进行性减少和椎间盘营养障碍，所以椎间盘软骨终板血管芽数量减少，引起血液灌流量减少，便形成“淤”的表现。

在上述变化中，软骨终板钙化的影响尤为重要，因为椎间盘营养通过软骨终板中央部位的弥散是其主要供应途径。Roberts S等[9]通过研究狨猴和人不同年龄的椎体软骨终板后发现，从成年后随年龄增加，椎体关节软骨层逐渐钙化。Oda J等[10]认为，营养物质与代谢废物通过终板转运的最重要因素是钙化软骨的厚度和完整性，以及软骨下血管数量、大小和与终板直接毗邻的骨髓腔多少。彭宝淦等[11]研究了从新生至老年的人类颈椎间盘后发现，髓核与终板交界处的细胞活力最强，进而推测髓核细胞起源于终板软骨细胞表层。只要软骨终板保持良好状态，髓核就可再生，终板的退变最终导致髓核的退变，而终板退变的标志是软骨内钙化。我们通过比较椎间盘退变程度与钙化关节软骨厚度发现，两者呈高度一致性，即关节软骨钙化层越厚，椎间盘退变越严重。关节软骨的不断钙化和骨化导致椎间盘营养发生障碍可能是启动椎间盘退变的关键因素。

中医学认为颈椎病的成因，主要是由于风寒湿邪客于膀胱经，使寒邪凝于太阳膀胱之血脉，使经脉拘挛，血液凝滞不畅，久而成瘀。颈部的外伤必然导致局部经脉气血的瘀滞不通；慢性劳损由于长久的积累性损伤，会导致气血失和，经脉不通。日久血瘀痰聚，累及肝、肾经督脉，则病根深入，缠绵难愈。颈椎病从经脉辨证来看，为膀胱经所主病，因此在选穴上根据“循经取穴”及“经脉所过，主治所及”的原则，应取膀胱经穴或相近的穴位为主。天柱为足太阳膀胱经脉气之所发，功能清头散风，通经活络，为治颈项病要穴。大椎为手足三阳经与督脉之会，总领诸阳经，针刺之可振奋督脉阳气，缓解痉挛。大杼位于项部，为骨会，手足太阳经交会穴。诸穴活血化瘀，疏经通络止痛。电针能加强针刺得气感，促进局部血液循环，调整肌张力，改善组织营养[12]。

通过本实验研究发现，针刺可延缓颈椎间盘的退变，防止髓核组织的皱缩。针刺组大鼠软骨终板钙化层厚度低于模型组(P<0.05)，非钙化层厚度高于模型组(P<0.05，P<0.01)，说明针刺可延缓软骨终板钙化，增加非钙化层厚度。针刺组软骨终板交界面血管芽数量较模型组增加(P<0.05)，说明针刺可以增加退变椎间盘血管芽数量。从而进一步证实了针刺可延缓软骨终板钙化，减轻软骨终板钙化程度，增加血管芽数量，提高髓核营养供应，起到缓解疼痛、延缓颈椎间盘退变的作用。

参考文献

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[11]彭宝淦，侯树勋，吴仕良.颈椎病突出椎间盘组织炎性反应特性的研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2002，12(1):38-40.

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(本文编辑：习沙)

Effects of acupuncture on the cartilage end-plate structure and interface blood buds in rats with cervical intervertebral disc degeneratio

WANGYing,PENGWei.

CenterofClinicalService,TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Hubei,Shiyan442000

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on the cartilage end-plate structure and interface blood buds in rats with cervical intervertebral disc degeneration. Methods 60 Male SD rats were randomly divided into blank, model and acupuncture group, 20 rats in each group. The model of cervical intervertebral disc degeneration was established in model and acupuncture group. The rats in acupuncture group received electrical acupuncture, and the rest two groups did not be disposed. After three courses, all rats were sacrificed. The histological examination was performed, including the calcified and un-calcified layer in cartilage end-plate and the number of vascular bud was observed. Results The number of vascular bud of cartilage end-plate in model group was decreased as compared with that in blank group (P<0.01), proved successful model. The number of vascular bud in acupuncture group was higher than that in model group (P<0.05). The thickness of calcified layer in model group was higher than that in blank group (P<0.05), and the thickness of un-calcified layer was lower (P<0.05), proved successful model. The thickness of calcified layer acupuncture group was lower than that in model group (P<0.05), and the thickness of un-calcified layer was higher than that in blank group (P<0.05). Conclusion Acupuncture can prevent the calcification of cartilage end-plate in rats with cervical intervertebral disc degeneration, reduce degree of calcification, and increase blood bud, enhance nutrient supplement of nucleus pulposus, has the effects of relieve pain and slow the degenerative process of cervical intervertebral disc.

【Key words】Cervical vertebra; Pathology; Intervertebral disc; Animals; Experiment; Acupuncture; Chondrocyte

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.05.025

通讯作者：△湖北医药学院附属太和医院保卫处，湖北十堰442000

作者简介：王莹(1978—)，女，主管护师，学士。从事针灸康复疾病的研究工作。

【中图分类号】R744.202.5；R-332；R329.24；R35

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2016)05-0729-04

(收稿日期：2014-12-25)