iNOS抑制剂1400W对人舌鳞癌CAL-27细胞株黏附力的研究

何海蕾 王羽 郭小青 彭卫卫 祝伟 邓江华 李勇 黄新帮 邓建鸿

iNOS抑制剂1400W对人舌鳞癌CAL-27细胞株黏附力的研究

何海蕾 王羽 郭小青 彭卫卫 祝伟 邓江华 李勇 黄新帮 邓建鸿

目的 探讨缺氧条件培养下诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂1400W对人舌鳞癌CAL-27细胞株黏附能力的影响。方法 MTT法检测1400W对人舌鳞状癌细胞CAL-27黏附能力的影响。结果 细胞黏附率与对照组比较明显下降(P＜0.05)。1400W作用于人舌鳞癌CAL-27细胞后，可呈时间、剂量性依赖抑制人舌鳞癌黏附能力(P＜0.05)。结论 1400W可明显抑制人舌鳞癌的黏附能力。1400W对人舌鳞状细胞癌生长、侵袭、转移具有预防和潜在的治疗价值。

人舌鳞癌；1400W；黏附力

舌鳞癌为最常见的严重危害性口腔癌之一，多呈浸润生长，常累及舌根、舌腹、舌根、咽侧壁、口底等区域，颈部复发易累及Ⅰ、Ⅱ区，极罕见的情况可累及腮腺，甚至转移至其他部位，其预后很差，疼痛溃烂严重影响患者吞咽言语，直至影响生命，患者后期非常痛苦[1]。与癌进展关系密切的是诱导型一氧化氮合酶（iNOS），因此抑制一氧化氮合酶的活性及作用是可行性方案[2]。本研究给予不同浓度的1400W作用相应时间，观察其对舌鳞癌细胞黏附力的情况进而研究抑制肿瘤的可能性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞培养条件 让人舌鳞癌CAL-27细胞株培养于正常湿度37℃、95%氮气和5%CO2缺氧条件下用含10%新生牛血清的培养液培养成细胞悬液，设立实验组及对照组。预实验初步筛选出最佳浓度及时间（200μmol/L、90min）。

1.2 MTT法检测1400W 对人舌鳞癌细胞CAL-27黏附能力的影响 实验组加相应1400W浓度，对照组加等体积DMEM液。设定实验组和对照组。MTT法检测1400W：对人舌鳞癌细胞CAL-27黏附能力的影响，将相应1400W浓度作用于实验组，加等体积DMEM液于对照组。各组在37℃缺氧条件下培养相应时间，用含10%新生牛血清的培养液配成单个细胞悬液，再将各组分别以0.1%胰蛋白酶消化，配成浓度为1×105/mL的细胞悬液，取200μL入96孔每孔培养板中，每孔8×103～10×103个细胞，再加用人工基膜Matrigel（用DMEM稀释的）10μL于每孔常规培养，待成胶后先予紫外光消毒灭菌，每组设4个平行孔，重复3次。4个平行孔于作用30、60、90、120min各时间点分别取出各组培养液及悬浮细胞，继续加入无血清的DMEM200μL培养，取20μL MTT培养4h，加二甲亚砜(DMSO)200μL，震荡2min取出进行黏附能力的测定。在以空白孔调零，经酶联免疫检测仪在波长490nm下测定每个OD值。细胞黏附率=（处理组平均OD值/对照组平均OD值）× 100%。黏附抑制率=[1-（处理组平均OD值/对照组平均OD值）]×100%。所有实验重复3次，计算平均抑制率。

1.3 观察指标 研究相同浓度的1400W对人舌鳞癌细胞作用不同时间黏附抑制率，证明其呈作用时间依赖性能抑制肿瘤异质性黏附能力及研究不同浓度1400W对人舌鳞癌细胞作用相同时间黏附抑制率的抑制，证明其呈剂量依赖性能抑制肿瘤异质性黏附能力。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料用“x±s”表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 200μmol/L的1400W作用不同时间对人舌鳞癌细胞抑制率的影响 200μmol/L1400W作用30、60、90、120min，各时间组人舌鳞癌CAL-27黏附抑制率与相应对照组比较有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。黏附抑制率分别为14%、19%、24%、31%，1400W可呈时间依赖性抑制人舌鳞癌黏附能力。

表1 用200μmol/L的1400W作用不同时间对人舌鳞癌细胞抑制率的影响（x±s，%）

2.2 不同浓度1400W作用90min对人舌鳞癌细胞胞抑制率的影响 用50、100、200、400μmol/L浓度1400W处理90min后，各浓度组舌鳞癌CAL-27黏附率与相应对照组比较有明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。黏附抑制率分别为16%、20%、24%、30%，1400W可呈剂量依赖性抑制人舌鳞癌黏附能力。

表2 不同浓度1400W作用90min对人舌鳞癌细胞胞抑制率的影响（x±s，%）

3 讨论

细胞的黏附能力在维持细胞外形、调节细胞分裂、运动等功能中起重要作用。异质性黏附能力是肿瘤发生浸润的始动步骤，其黏附力的提高导致肿瘤细胞突破基底膜这一机械屏障脱离原发灶并黏附至邻近组织。舌癌的浸润转移即是一个由黏附起始的复杂的病理过程[3]：其中异质黏附力是恶性肿瘤浸润和转移的关键环节。故用MMT法检测其黏附能力是有效的方法。研究已证明，MMP-9能加强肿瘤细胞粘黏附力构成瘤细胞移动的通道，最终导致肿瘤的侵袭和转移。而iNOS与MMP-9具有高度协同作用[4-5]，其产生的NO可通过作用于MMP-9调节血管生成，从而影响肿瘤浸袭和转移[6]。本研究前期研究已证实1400W对iNOS与MMP-9在舌鳞癌的表达有明显抑制作用，可呈时间、剂量性依赖。

本研究在缺氧条件培养下培养模拟肿瘤生长的缺氧环境，对不同浓度1400W作用不同时间干预后检测不同浓度1400w作用不同时间后黏附能力的影响，发现在一定范围内随着浓度的增加和时间的延长，肿瘤黏附能力逐渐降低，即1400W对其的黏附抑制率越高，以200μmol/L抑制最为明显。由实验可知1400W对舌鳞癌黏附能力，具有抑制作用。

1400W是目前为止最有效的iNOS抑制剂[7]。目前已有1400W抑制其他肿瘤组织的研究[8-11]，但1400W对舌鳞癌细胞作用及影响少见报道。本研究用不同浓度1400W作用不同时间干预舌癌细胞后用MTT法检测代表肿瘤的黏附能力的相关性，发现随着浓度的增加和时间的延长舌鳞癌CAL-27细胞黏附力逐渐降低。提示1400W作用于人舌鳞癌CAL-27细胞后，发挥抑瘤作用并且可呈时间、剂量性依赖抑制人舌鳞癌黏附能力，对舌鳞癌的黏附浸润具有明显阻止的影响，为1400W应用于临床控制舌癌的进展提供了新的思路。

[1] 李鸿艺，翦新春.舌癌复发的危险因素分析及其侵犯范围研究[D].长沙：中南大学，2011.

[2] Itatsu K,Zen Y,Yamaguchi J,et al.Expression of matrix metalloproteinase 7 is an unfavorable postoperative prognostic factor in cholangiocarcinoma of the perihilar,hilar,and extrahepatic bile ducts[J].Hum Pathol，2008,39（5）：710-719.

[3] Jerome Gross.How tadpoles lose their tail：path to discovery of the first matrix metallo-proteinase[J].Matrix Biology,2004,23：3-13.

[4] Deryugina EI,Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2006，25（1）：9-34.

[5] Sun MH,Han XC,Jia MK,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase and matrix metallop roteimase-9 and their effets on angiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol, 2005，11(38)：5931-5937.

[6] 张秀静，王心彧，张国梁，等.植物乳杆菌代谢产物和Ca2+诱导人舌鳞癌CAL-27细胞凋亡的研究[J].黑龙江医药科学，2013，36(2)：16-17.

[7] 叶君，成雁，陈亚萍.INOS抑制剂1400W通过P53途径增强顺铂对宫颈癌SiHa细胞的化疗效果[J].中国细胞生物学学报，2015，37（4）：522-528.

[8] 邢宏松，黄长文，傅华群，等．选择性iNOS抑制剂1400W对缺氧培养人肝癌SMMC27721细胞株iNOS和VEGF表达的影响[J]．实用临床医学，2008，9(9)：3-6.

[9] 叶君，孙红.iNOS抑制剂1400W宫颈癌Hela细胞株生长的抑制作用[J].复旦学报（医学版），2009，36(2)：177-181.

[10] 吴京蔓，吴勇.舌鳞癌Cal27裸鼠移植瘤模型的建立及其意义[J].昆明医科大学学报，2015，36（5）：5-7.

[11] 张海霞，胡春宏，刘欧胜，等.诱导性一氧化氮抑制剂对鼻咽癌CNE-2细胞株作用的探讨[J].中国现代医学杂志，2011，21（18）：2090-2096.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.28.013

市科技局立项编号（GZ2014ZSF229）

江西 341000 赣州市人民医院口腔颌面外科 （何海蕾 王羽李勇 黄新帮 邓建鸿） 赣州市人民医院肿瘤科 （郭小青 彭卫卫 邓江华）赣州市人民医院实验室（祝伟）