肉桂酸及其衍生物对双孢蘑菇致腐微生物的体外抑菌效果比较

柯莉娜,胡泳华,高焕娟,潘志针,王　勤*

(1.厦门大学 生命科学学院,滨海湿地生态系统教育部重点实验室,福建厦门361102;2.福建省农业科学研究院农业生物资源研究所,福建福州350003)

肉桂酸及其衍生物对双孢蘑菇致腐微生物的体外抑菌效果比较

柯莉娜1,胡泳华1,高焕娟1,潘志针2,王勤1*

(1.厦门大学 生命科学学院,滨海湿地生态系统教育部重点实验室,福建厦门361102;2.福建省农业科学研究院农业生物资源研究所,福建福州350003)

摘要：双孢蘑菇(Agaricus bisporus (Lange) Sing)组织细嫩,营养价值高,采后呼吸代谢旺盛,为微生物的生长繁殖提供了有利条件,但容易引起一些不良的生理反应,加速组织的衰老和腐败,极大地降低了双孢蘑菇的商品价值.本文从腐烂的双孢蘑菇中分离鉴定得到6株细菌和8株真菌,分别为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens,2株)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca,1株)、不动杆菌属(Acinetobacter guillouiae,1株)、沙雷氏菌属(Serratia sp.,1株)和阿氏肠杆菌(Enterobacter asouriae,1株)以及哈茨木霉(Trichoderma harzianum,5株)、多变根毛霉(Rhizomucor variabilis,1株)、绿色木霉(T. viride,1株)和米根霉(Rhizopus oryzae,1株).分别采用琼脂扩散法和生长速率法测定了肉桂酸及其衍生物对上述细菌和真菌的抑制作用,研究结果表明肉桂酸及衍生物对这些菌株有不同程度的抑制作用,抑制效果的强弱依次为4-甲基肉桂酸> 4-甲氧基肉桂酸>肉桂酸> 4-羟基肉桂酸.本研究结果可为双孢蘑菇的采后防腐提供依据.

关键词：肉桂酸衍生物;双孢蘑菇;细菌;真菌

双孢蘑菇(Agaricusbisporus(Lange) Sing)色泽洁白,组织细嫩,味道鲜美,营养价值高,不仅是一种高档的菌类蔬菜,而且是一种具有保健功能的营养食品.双孢蘑菇含有17种氨基酸,所含的蛋白质几乎高于所有的豆类和蔬菜[1].双孢蘑菇在采收后,虽然离开了培养基中水分和养分的供给,同化作用基本停止,但是生命活动仍在继续，仍然是活的有机体;由于其含水量高,采后呼吸代谢旺盛,极易出现失水萎蔫、褐变、开伞,同时也为微生物的生长繁殖提供了有利条件,因此易引发一些不良的生理反应,破坏正常的组织代谢,加速组织的衰老和腐败,极大地降低了双孢蘑菇的商品价值[2].陈少珍等[3]分离鉴定了蘑菇黑斑病病原菌,李河等[4]分离鉴定了褐腐病病原菌,Graupner等[5]通过质谱成像及基因组分析研究了双孢蘑菇软腐病病原菌Janthinobacteriumagaricidamnosum中抗真菌毒力因子的特征,冯伟林等[6]研究了不同覆土基质微生物的结构特征对双孢蘑菇产量、质量的影响.目前对双孢蘑菇中微生物的研究主要集中于蘑菇的病害菌,而对于引起蘑菇腐烂的微生物并未见报道.

肉桂酸是一种天然提取物,安全无毒,微有桂皮气味.目前对肉桂酸及其衍生物的研究包括了酪氨酸酶抑制剂[7]、抑菌作用[8]、保鲜作用[9].我们的前期研究发现肉桂酸及其衍生物可以延缓双孢蘑菇的褐变,同时双孢蘑菇在采后易发生腐烂,而由于微生物作用导致的腐烂是否能够同时被肉桂酸及其衍生物所抑制尚不清楚.因此,本研究首先从腐烂蘑菇中分离鉴定致腐菌株,继而研究肉桂酸及其衍生物对这些菌株的抑制作用,该研究结果可为今后肉桂酸及其衍生物在采后双孢蘑菇防微生物腐烂的应用提供理论和实践基础.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

菌株均由福建省农业科学研究院农业生物资源研究所分离得到.从腐烂蘑菇中分离到的6株细菌菌株编号分别为:FJAT-17802、FJAT-17804、FJAT-17805、FJAT-17806、FJAT-17807、FJAT-17808.从腐烂蘑菇中分离到的8株真菌菌株编号分别为:FJAT-30524、FJAT-30525、FJAT-30526、FJAT-30527、FJAT-30528、FJAT-30529、FJAT-30530、FJAT-30531.

1.1.2培养基

细菌培养采用的是LB培养基,真菌培养采用的是PDA培养基.

1.1.3试剂

肉桂酸、4-甲基肉桂酸和4-羟基肉桂酸为上海生工生物工程股份有限公司产品;4-甲氧基肉桂酸为Sigma-Aldrich公司产品;脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、Taq酶(5 U/μL)为上海博尚生工生物工程技术服务有限公司产品;其他试剂均为国产分析纯试剂;蒸馏水为去离子重蒸水(ddH2O).

1.1.4引物

细菌通用16S rRNA引物:9F(5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1542R(5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′);真菌通用引物:ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′).上述引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成.

1.2方法

1.2.1细菌菌株鉴定

采用龙雯等[10]的方法,进行修改后如下:将菌种在固体LB培养基上划线活化,30 ℃培养2 d.收集细菌提取DNA,采用25 μL PCR反应体系(10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL,ddH2O 18.7 μL,DNA模板1 μL)进行扩增.PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min 30 s,35个循环；最后72 ℃延伸10 min.用1.5%(质量分数)的琼脂糖凝胶对产物进行检测,检测出有条带的菌株PCR产物送至上海博尚生工生物工程技术服务有限公司进行测序,将结果进行16S rRNA鉴定,所得序列在NCBI网站上进行序列比对分析.

1.2.2真菌菌株鉴定

采用修改后的华娟等[11]的方法:将菌种在添加硫酸链霉素的固体PDA培养基(每200 mL培养基中加入1 mL 40 mg/mL的硫酸链霉素)上划线活化,28 ℃培养2 d.采用尿素提取法提取菌株的DNA,采用25 μL PCR反应体系(10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL，ddH2O 18.75 μL，DNA模板1 μL)进行扩增.PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环；最后72 ℃延伸10 min.电泳检测、PCR产物测序及序列比对分析同上.

1.2.3肉桂酸及其衍生物对细菌的抑制作用检测

采用琼脂扩散法测定抑菌圈大小[12].将-20 ℃冷冻保藏的供试菌在固体LB培养基上划线活化,置于37 ℃恒温培养24 h.从活化后的各菌落中挑取单菌落,接种于25 mL的液体LB培养基中,于37 ℃、200 r/min下摇床培养24 h,制备菌悬液.将灭菌后的固体LB培养基(含1%(质量分数，下同)的琼脂)约15 mL倒入灭菌后的平皿中,配制底层培养基,过夜保证无污染.将灭菌后的LB培养基(含0.7%的琼脂)冷却至50 ℃,接种实验菌(菌密度为106mL-1),摇匀,倒在底层平板上，配制上层培养基.用打孔器在平板上打孔,孔直径为0.7 cm,每个平板7个孔,分别设置5个效应物浓度(1.25,2.5,5,10,20 mmol/L)、1个阴性对照(二甲基亚砜)、1个阳性对照(2 000 U/mL庆大霉素),37 ℃恒温培养24 h,观察结果,并用游标卡尺测定抑菌圈大小,每个实验设置3个重复.

1.2.4肉桂酸及其衍生物对真菌的抑制作用检测

采用生长速率法[13].将-20 ℃冷冻保藏的供试菌在固体PDA培养基上划线活化,置于30 ℃恒温活化48 h.将约20 mL灭菌后的PDA培养基(含1%的琼脂)与400 μL梯度稀释的效应物混合倒入平皿中.然后将培养好的真菌打成直径为0.7 cm的菌饼(初始菌饼)贴于平皿中央,使有菌丝的一面朝下,每个平皿一个浓度(1.25,2.5,5,10,20 mmol/L),以未添加效应物组作为对照,30 ℃恒温培养48 h,观察结果,并用游标卡尺采用十字交叉法测定菌落直径,每个实验设置3个重复,计算抑制率,公式如下:

抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/

(对照菌落直径-初始菌饼直径)×100%.

1.2.5数据分析

实验数据采用Excel软件进行统计分析,结果用平均值±标准差表示.

2结果与分析

2.1腐烂双孢蘑菇中细菌的分离纯化及鉴定

从腐烂蘑菇中分离出6株细菌(图1),经16S rRNA鉴定,FJAT-17802和FJAT-17804为黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens),其中FJAT-17802序列长度1 400 bp,FJAT-17804序列长度1 013 bp；FJAT-17805为产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca),序列长度1 395 bp；FJAT-17806为不动杆菌属(Acinetobacterguillouiae),序列长度1 396 bp；FJAT-17807为沙雷氏菌属(Serratiasp.),序列长度1 405 bp；FJAT-17808为阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae),序列长度1 407 bp.

(a)～(f)分别为FJAT-17802、FJAT-17804、FJAT-17805、FJAT-17806、FJAT-17807和FJAT-17808．图1　腐烂双孢蘑菇中细菌的分离纯化鉴定Fig.1The bacteria isolated from rotten A． bisporus

2.2腐烂双孢蘑菇中真菌的分离纯化及鉴定

从腐烂的双孢蘑菇中分离得到8株真菌(图2).经鉴定，FJAT-30524为哈茨木霉(Trichodermaharzianum),序列长度639 bp;FJAT-30525为哈茨木霉,序列长度629 bp;FJAT-30526为多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis),序列长度655 bp;FJAT-30527为绿色木霉(T.viride),序列长度638 bp;FJAT-30528为哈茨木霉,序列长度640 bp;FJAT-30529为哈茨木霉,序列长度642 bp;FJAT-30530为哈茨木霉,序列长度625 bp;FJAT-30531为米根霉(Rhizopusoryzae),序列长度650 bp.

(a)～(h)分别为FJAT-30524、FJAT-30525、FJAT-30526、FJAT-30527、FJAT-30528、FJAT-30529、FJAT-30530和FJAT-30531.图2　双孢蘑菇中真菌的分离纯化鉴定Fig.2The fungi isolated from rotten A． bisporus

2.3肉桂酸及其衍生物对腐烂双孢蘑菇中细菌的抑制作用

采用琼脂扩散法研究肉桂酸及其衍生物对从腐烂的双孢蘑菇中分离出的细菌的抑制作用,其中黏质沙雷氏菌以FJAT-17802为代表.肉桂酸及其衍生物对阿氏肠杆菌的作用如图3(a)所示：肉桂酸对阿氏肠杆菌无抑制作用;4-甲基肉桂酸和4-甲氧基肉桂酸对其有轻微抑制作用,但效果不显著;而4-羟基肉桂酸对其的抑制作用不显著.肉桂酸及其衍生物对黏质沙雷氏菌的作用如图3(b)所示：4-甲基肉桂酸和4-甲氧基肉桂酸对黏质沙雷氏菌的抑制效果不显著,而肉桂酸和4-羟基肉桂酸对黏质沙雷氏菌的生长无影响.肉桂酸及其衍生物对沙雷氏菌属的作用如图3(c)所示：当肉桂酸浓度达到5 mmol/L时,对沙雷氏菌属的抑制效果比阳性对照好;而4-甲氧基肉桂酸对沙雷氏菌属有轻微抑制作用,但效果不显著;4-甲基肉桂酸和4-羟基肉桂酸对沙雷氏菌属的生长无影响.

图3　肉桂酸及衍生物对腐烂双孢蘑菇中阿氏肠杆菌(a)、黏质沙雷氏菌(b)、沙雷氏菌属(c)的抑制作用Fig.3Antimicrobial activities of cinnamic acid and its derivatives to E. asburiae (a), S. marcescens (b) and Serratia sp. (c) from rotten A. bisporus

此外，我们也研究了肉桂酸及其衍生物对不动杆菌属和产酸克雷伯菌的抑制效果,研究结果表明,它们对这2种细菌的生长并无抑制作用.

2.4肉桂酸及其衍生物对腐烂双孢蘑菇中真菌的抑制作用

采用生长速率法研究肉桂酸及其衍生物对腐烂的双孢蘑菇中筛选鉴定得到的真菌的抑制作用,其中哈茨木霉以FJAT-30524为代表.肉桂酸及其衍生物对绿色木霉的作用如图4(a)所示：对绿色木霉的抑制作用强弱依次为4-甲基肉桂酸>4-甲氧基肉桂酸>肉桂酸,当浓度达到20 mmol/L时,抑制率分别为50.00%，47.89%和33.33%.肉桂酸及其衍生物对哈茨木霉的作用如图4(b)所示：对哈茨木霉的抑制作用强弱依次为4-甲基肉桂酸>4-甲氧基肉桂酸>肉桂酸>4-羟基肉桂酸,当浓度达到20 mmol/L时,抑制率分别为100%，39.19%，10.00%和4.00%.肉桂酸及其衍生物对米根霉的作用如图4(c)所示：当浓度达到20 mmol/L时,肉桂酸、4-甲基肉桂酸和4-甲氧基肉桂酸对米根霉的抑制率均达到100%.肉桂酸及其衍生物对多变根毛霉的作用如图4(d)所示：随着浓度的升高,4-甲基肉桂酸和4-甲氧基肉桂酸对多变根毛霉的抑制率均呈上升趋势,而4-甲基肉桂酸的抑制效果优于4-甲氧基肉桂酸,当浓度达到20 mmol/L时,抑制率分别为48.61%和18.82%.此外，肉桂酸对多变根毛霉的生长无影响,4-羟基肉桂酸对绿色木霉、米根霉、多变根毛霉均为无抑制作用.

3讨论

本实验鉴定得到的黏质沙雷氏菌菌落有黏性，呈中心颗粒状,有恶臭气味,广泛存在于水、土壤和食品中,在28 ℃下培养有玫瑰红色色素产生,所产红色素会随着培养时间的变化而变化,培养时间越长,颜色越淡[14].克雷伯菌属机会致病菌,呼吸道常居菌群,在人及动物肠道中亦常见,其中产酸克雷伯菌已被确认为病原菌[15],而本实验分离得到的产酸克雷伯菌是否具有致病性还需进一步验证.肠杆菌科细菌分布广,寄主范围大,与人类关系密切.不动杆菌属为非发酵菌，是条件致病菌,其腐生性致病性需进一步验证.

图4　肉桂酸及衍生物对腐烂双孢蘑菇中绿色木霉(a)、哈茨木霉(b)、米根霉(c)和多变根毛霉(d)的抑制作用Fig.4Antimicrobial activities of cinnamic acid and its derivatives to T. viride (a), T. harzianum (b), R. oryzae (c) and R. variabilis (d) from rotten A. bisporus

哈茨木霉被认为是具有重要价值的生防菌,主要通过识别寄主后缠绕寄主真菌的菌丝,随后产生细胞壁降解酶和抗生素，以及对空间和营养的竞争机制，达到防治植物病原菌的目的[16].绿色木霉也属于生防菌,对多数植物病原菌有抑制作用.多变根毛霉多见于医学性致皮肤病的病菌,但在2008年,广东从泰国进口的腐烂榴莲中首次分离到多变根毛霉[17],而早在1992年,杨坚[18]就对苹果腐烂菌群进行了分析,从中分离了5株毛霉属真菌.米根霉菌丝发达,对于其是否导致新鲜蘑菇腐烂以及是否通过产生L-乳酸和富马酸等有机酸代谢产物来加快蘑菇腐烂[19],或者这些代谢产物是否能杀死其他腐生菌从而达到蘑菇保鲜的作用等仍需进一步探讨.

本实验从腐烂的双孢蘑菇中分离鉴定得到6种细菌和8种真菌,探讨了肉桂酸及其衍生物对这些菌株的作用,结果显示这些菌株对4-羟基肉桂酸均不敏感.4-甲基肉桂酸对阿氏肠杆菌、哈茨木霉、多变根毛霉、绿色木霉和米根霉的抑制效果均优于其他化合物,4-甲氧基肉桂酸的效果仅次于4-甲基肉桂酸,而肉桂酸对沙雷氏菌属有很好的抑制效果.我们推测由于取代基的不同导致了肉桂酸及其衍生物的抑菌效果不同：由于4-甲氧基和4-甲基的结构较为相近,因此这2种化合物的抑菌效果也较为相近;而羟基的水溶性较好,使得该物质进入细胞较为不易从而导致4-羟基肉桂酸的抑菌效果相对较差.我们的研究结果将为肉桂酸及其衍生物在采后双孢蘑菇防腐的应用提供进一步的理论和实践基础.

参考文献：

[1]MEND D,SONG T,SHEN L,et al．Postharvest application of methyl jasmonate for improving quality retention ofAgaricusbisporusfruit bodies[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(23):6056-6062.

[2]JIANG T．Effect of natamycin in combination with pure oxygen treatment on postharvest quality and selected enzyme activities of button mushroom (Agaricusbisporus)[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(10),2562-2568.

[3]陈少珍,黄思良,黄卓忠,等.蘑菇黑斑病病原菌分离与鉴定[J].广西农业科学,2009,40(1):43-46.

[4]李河,周国英,刘君昂.双孢蘑菇褐腐病病原菌的分离及分子鉴定[J].食用菌学报,2009,16(2):74-76.

[5]GRAUPNER K,SCHERLACH K,BRETSCHNEIDER T,et al．Imaging mass spectrometry and genome mining reveal highly antifungal virulence factor of mushroom soft rot pathogen[J]．Angewandta Chemie International Edition,2012,51(52):13173-13177.

[6]冯伟林,金群力,范丽军,等.不同覆土基质微生物结构特征研究及其对双孢蘑菇产量的影响[J].菌物学报,2014,33(2):425-432.

[7]SHI Y,CHEN Q X,WANG Q,et al．Inhibitory effects of cinnamic acid and its derivatives on the diphenolase activity of mushroom (Agaricusbisporus) tyrosinase[J]．Food Chemistry,2005,92(4):707-712.

[8]梁盛年,段志芳,付莉,等.几种肉桂酸衍生物与肉桂酸抑菌作用比较研究[J].食品科技,2005(9):71-73.

[9]HU Y H,CHEN C M,XU L,et al．Postharvest application of 4-methoxy cinnamic acid for extending the shelf life of mushroom (Agaricusbisporus)[J]．Postharvest Biology and Technology,2015,104:33-41.

[10]龙雯,陈存社.16S rRNA测序在细菌鉴定中的应用[J].北京工商大学学报(自然科学版),2006,24(5):10-12.

[11]华娟,李淋玲,程华,等.罗田栗实致腐真菌的分离鉴定及拮抗菌筛选[J].中国农学通报,2013,29(25):102-107.

[12]ZHU Y J,ZHOU H T,HU Y H,et al．Antityrosinase and antimicrobial activities of 2-phenylethanol,2-phenylacetaldehyde and 2-phenylacetic acid[J]．Food Chemistry,2011,124(1):298-302.

[13]XU J G,ZHAO X M,HAN X W,et al．Antifungal activity of oligochitosan againstPhytophthoracapsiciand other plant pathogenic fungiinvitro[J]．Pesticide Biochemistry and Physiology,2007,87(3):220-228.

[14]黄文芳.黏质沙雷氏菌(Serrtiamarcescens)的研究Ⅰ:黏质沙雷氏菌9-2菌株分离、分类鉴定和形态特征[J].华南师范大学学报(自然科学版),2003(3):108-111.

[15]盂静,王锐.牛奶中一株产酸克雷伯菌的检出[J].食品工程,2010(3):53-56.

[16]石一瑁,申屠旭萍,俞晓平.重寄生菌哈茨木霉的研究及其在植病生防中的应用[J].生物技术通报,2008(增刊1):76-78.

[17]王卫芳,胡佳,陈晓玲,等.广东口岸从泰国进境榴莲上截获果腐病菌多变根毛霉[J].植物检疫,2009(4):60.

[18]杨坚.苹果腐烂菌群分析[J].食品科学,1992(11):48-50.

[19]付永前,黄和,李霜,等.固定化米根霉发酵生产有机酸的现状及发展趋势[J].现代化工,2008,28(12):88-91.

Antimicrobial Activities of Cinnamic Acid and Its Derivatives to Microorganisms Isolated from Rotten Agaricus bisporus

KE Lina1,HU Yonghua1,GAO Huanjuan1,PAN Zhizhen2,WANG Qin1*

(1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Coastal and Wetland Ecosystems,School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China;2.Agricultural Bioresource Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

Abstract:Agaricus bisporus has a vigorous respiration after harvesting,due to its delicate tissue and the high nutritional value,which provides favorable conditions for the growth of microbes,causing some bad physiological reaction,accelerating the aging and corruption,and greatly reducing the commodity value of A． bisporus．We identified six bacterial strains and eight fungal strains from rotten A． bisporus,which are Serratia marcescens(2),Klebsiella oxytoca(1),Acinetobacter guillouiae(1),Serratia sp.(1),Enterobacter asburiae(1),and Trichoderma harzianum(5),Rhizomucor variabilis(1),T. viride(1) and Rhizopus oryzae(1)．Moreover,antimicrobial activities of cinnamic acid and its derivatives were investigated．The results showed that cinnamic acid and its derivatives exhibited different degrees of the growth inhibition on microbia．The strength of inhibition effects decreases following the sequence of 4-methyl cinnamic acid,4-methoxy cinnamic acid,cinnamic acid and 4-hydroxy cinnamic acid．These results may provide theoretical and practical basis in the application of antimicrobial rotting of postharvest A． bisporus in the future.

Key words:cinnamic acid derivatives;Agaricus bisporus;bacteria;fungi

doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2016.03.005

收稿日期：2015-09-29录用日期：2015-12-28

基金项目：国家自然科学基金(31271952);中国博士后科学基金(2015M570556)

*通信作者：qwang@xmu.edu.cn

中图分类号:Q 936

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)03-0330-06

引文格式：柯莉娜,胡泳华,高焕娟，等.肉桂酸及其衍生物对双孢蘑菇致腐微生物的体外抑菌效果比较.厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(3)：330-335.

Citation：KE L N,HU Y H,GAO H J,et al．Antimicrobial activities of cinnamic acid and its derivatives to microorganisms isolated from rottenAgaricusbisporus.Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(3)：330-335．(in Chinese)