槐花多糖对小鼠免疫调节作用的试验

2016-06-22陈忠杰李利红李存法河南牧业经济学院河南郑州450011

中国兽医杂志 2016年3期

陈忠杰，李利红，李存法，胡　燕（河南牧业经济学院，河南郑州450011）

槐花多糖对小鼠免疫调节作用的试验

陈忠杰，李利红，李存法，胡燕
（河南牧业经济学院，河南郑州450011）

摘要：以槐花为试材，研究槐花多糖对小鼠的免疫调节作用。将槐花多糖用生理盐水配制成一定浓度的溶液，以腹腔注射的方法作用于小鼠，测定小鼠外周血和脾脏淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞活性和免疫器官指数等指标的变化。结果1.0 mL/d的槐花多糖注射量可以显著促进小鼠外周血和脾脏淋巴细胞的增殖，提高小鼠巨噬细胞活性，并促进小鼠免疫器官的生长发育。

关键词：槐花；多糖；免疫调节

槐花（Sophora japonica）又名槐蕊，为豆科植物槐（Sophora japonica L）的干燥花朵及花蕾，前者习称为“槐花”，后者习称为“槐米”。槐花中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、多种维生素，还含有刀豆酸、槐花二醇、芸香苷、三萜皂苷、白桦脂醇、葡萄糖醛酸、芦丁等，使其具有抗氧化性、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、降压、扩冠等作用、降血脂作用、抑制醛糖还原酶作用、致突变作用等很多功能特性［1］。目前，对槐花的研究主要集中在黄酮类化合物上，把槐花作为提取芦丁的主要原料［2］。槐花的药理作用多样，化学成分复杂。为合理开发利用槐花资源，必须对槐花进行全面的研究［3］。多糖是自然界和生物体中广泛存在的物质，它是生物体内一类重要的大分子，具有提高免疫能力、降血糖、抗肿瘤、抗病毒等功能，是药理学研究的新热点。目前，对槐花多糖功能作用的研究较少，只涉及到其抗氧化［4］和抑菌功能［4］。本实验旨在研究槐花多糖对小鼠的免疫调节作用，为槐花作为免疫增强药物的开发提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试验材料昆明种纯系小鼠，5周龄，由河南牧业经济学院动物实验中心提供。

以干洋槐花为材料，用水提法提取槐花多糖。提取工艺为：干槐花→粉碎→过孔径为0.425 mm筛→乙醚脱脂→干燥后得脱脂样品→取脱脂样品，加适量蒸馏水→80℃浸提6 h→离心（4 000 r/min离心15 min）→沉淀加蒸馏水进行第2次提取（提取4次）→合并4次离心上清液→减压浓缩→浓缩液中加入乙醇，使其体积分数为80%→沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤→干燥，得粗多糖样品［3］。

1.2主要试剂淋巴细胞分离液，上海泛柯实业有限公司生产；噻唑蓝（MTT），上海源叶生物科技有限公司生产；二甲亚砜（DMSO），成都贝斯特试剂有限公司生产；青霉素、链霉素、小牛血清、刀豆蛋白A （ConA）和脂多糖（LPS），均由上海江莱生物科技有限公司生产；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3试验设计用生理盐水将槐花多糖样品配制成1 mg/mL的溶液供使用。取小鼠48只，随机均分为4组。其中三组为试验组，一组为对照组。试验Ⅰ组均每天分别腹腔注射槐花多糖每只0.5 mL，试验Ⅱ组均每天分别腹腔注射槐花多糖每只1 mL，试验Ⅲ组均每天分别腹腔注射槐花多糖每只1.5 mL，对照组Ⅳ组均每天分别腹腔注射生理盐水每只1 mL，连续7 d。其他饲养条件均按正常进行。在最后一次注射24 h后，每组随机抽取6只小鼠腹腔注射8%蛋白胨溶液2 mL，再24 h后进行眼眶采血，用500 IU/mL的肝素抗凝，随后加入等量的D-Hank′s液，测定外周血淋巴细胞的增值。随后快速宰杀小鼠，腹腔注射经灭菌的D-Hank′s液8 mL，收集腹腔液，测定腹腔巨噬细胞活性。最后采取脾脏，制备成单个细胞悬液，测定脾脏淋巴细胞的增值。每组所剩6只小鼠在最后一次注射24 h后，测定免疫器官指数。

1.4检测指标和方法

1.4.1淋巴细胞增殖测定采用MTT比色法。取上述待测样本，加入淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。分别加入96孔培养板，加入适量ConA或LPS，放置于37℃的CO2培养箱中培养72 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，继续放置于培养箱中培养4 h，每孔加入DSMO 100 μL溶解细胞。10 min后于酶标仪中检测A570值。

1.4.2巨噬细胞活性测定［5］取所收集的腹腔洗液于1 000 r/min离心10 min，用3 mL D-Hank′s液重悬，再离心洗涤1次；用1640完全培养液重悬，进行细胞计数（1×106/mL）。每组细胞悬液100 μL，重复4孔，置37℃培养箱中培养2 h后，换新鲜1 640培养液。继续孵育2 h后，各孔加10 μL MTT，轻摇1 min，温育4 h，加DMSO，震荡30 s，测A570值。

1.4.3免疫器官指数测定将小鼠空腹称重，用常规方法宰杀，分离出免疫器官脾脏和胸腺，并测定重量，计算出免疫器官指数。免疫器官指数=器官重g/活体重g。

1.5数据处理方法采用SPSS18.0统计软件进行，试验结果均以平均数±标准差表示，LSD法比较差异显著值，以P＜0.05为显著水平。

2　结果

2.1外周血淋巴细胞增殖变化槐花多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响见表1。与对照组相比，试验Ⅰ组（每只小鼠每天腹腔注射1 mg/mL的槐花多糖溶液0.5 mL），对ConA诱导和LPS诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应作用均不明显（P＞0.05）；试验Ⅱ组（每只小鼠每天腹腔注射1 mg/mL的槐花多糖溶液1.0 mL），能显著增强ConA诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应（P＜0.05），但对LPS诱导的该反应作用不明显（P＞0.05）；试验Ⅲ组（每只小鼠每天腹腔注射1mg/ml的槐花多糖溶液1.5 mL），对ConA诱导和LPS诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应均有明显作用（P＜0.05）。

表1　槐花多糖对小鼠外周血淋巴细胞增殖的影响

2.2脾脏淋巴细胞增殖变化槐花多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响见表2。与对照组相比，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组均对由ConA诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应作用不明显（P＞0.05），但试验Ⅲ组能显著增强由ConA诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应（P＜0.05）；三个试验组均对由LPS诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应作用不明显（P＞0.05）。

表2　槐花多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

2.3腹腔巨噬细胞活性变化槐花多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的调节作用见表3。与对照组相比，试验Ⅰ组对小鼠腹腔巨噬细胞活性的作用不明显（P＞0.05），而试验Ⅱ组和试验Ⅲ组均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的活性（P＜0.05）。

表3　槐花多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的调节作用

2.4免疫器官指数变化槐花多糖对小鼠免疫器官指数的影响见表4。与对照组相比，试验Ⅰ组对脾脏指数和胸腺指数的影响均不明显（P＞0.05）；试验Ⅱ组对脾脏指数影响不显著（P＞0.05），但能显著提高胸腺指数（P＜0.05）；试验Ⅲ组能显著提高脾脏指数和胸腺指数。

表4　槐花多糖对小鼠免疫器官指数的影响

3　小结与讨论

淋巴细胞是白细胞的一种。由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。通常分为T淋巴细胞和B淋巴细胞。淋巴细胞的增殖能力经常被用来评价机体免疫应答水平。槐花多糖有促进小鼠淋巴细胞增殖的作用，但是不同的注射量影响不同。如1.0 mL/d的多糖注射量可以显著增强由ConA诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖，但是0.5 mL/d的注射量作用不明显。这说明足量的槐花多糖才能达到较好效果。而且同一注射量对由ConA诱导或由LPS诱导的淋巴细胞增殖作用也不同。如1.0 mL/d的多糖注射量可以显著增强由ConA诱导的小鼠外周血淋巴细胞的增殖，但对由LPS诱导的淋巴细胞增殖作用则不明显。这可能是因为ConA诱导T细胞的增殖，而LPS诱导B细胞的增殖，所以槐花多糖中有效成分的作用机制不尽相同。

巨噬细胞也属于免疫细胞，但是其属于不繁殖细胞群，所以主要考查其活性。槐花多糖可以提高巨噬细胞活性。试验中，0.5 mL/d的注射量作用不明显，但是1.0 mL/d和1.5 mL/d的注射量均能显著增强巨噬细胞活性。同时，1.0 mL/d的注射量和1.5 mL/d的注射量对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响差异不大，说明多糖用量也不是越大越好。

免疫器官的发育状况直接影响机体免疫应答水平和抵抗外来微生物的感染和侵入的能力，其绝对重量和相对重量增加，说明机体的细胞免疫和体液免疫机能增强［6］。一定量的多糖注射量可以促进小鼠脾脏和胸腺的生长发育。但是不同注射量的影响不同。比如1.0 mL/d的注射量能显著促进小鼠胸腺的生长，但是对脾脏影响不明显。具体机理还有待进一步研究。

综上所述，一定的槐花多糖注射量可以明显增强小鼠外周血和脾脏淋巴细胞的增殖反应，提高小鼠腹腔巨噬细胞的活性，促进小鼠免疫器官的生长发育，从而提高小鼠免疫力。因此值得进一步深入研究和探讨，为槐花多糖作为免疫增强药物的开发提供更多科学依据。

参考文献：

［1］马利华.乳酸菌发酵对槐花营养及抗氧化性的影响［J］.食品工业科技，2009（4）：200-207.

［2］吴虹霁，兰昌云，陈媛.槐花的研究进展［J］.广东微量元素科学，2006，13（6）：1-6.

［3］王丽华，段玉峰，马艳丽，等.槐花多糖的提取工艺及抗氧化活性研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（8）：213-217.

［4］胡喜兰，姜琴，尹福军，等.正交实验优选槐花多糖的最佳提取工艺及抑菌活性研究［J］.食品科技，2012，37（4）：164-167.

［5］储岳峰，李祥瑞，胡元亮.9种中药成分对小鼠免疫细胞活性的影响［J］.南京农业大学学报，2004，27（1）：97-100.

［6］杨小燕，林跃鑫，李焰.银杏叶对肉鸡生长性能免疫功能和血清生化指标的影响［J］.中国兽医杂志，2007，43（2）：37-39.

中图分类号：R 282

文献标志码：B

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0115- 03

收稿日期：2014-09-29