广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆与序列分析

罗六龙，黄冬妮，黄良宗，马春全，梁梓森（.华南农业大学兽医学院，广东广州5064；.佛山科学技术学院，广东佛山583）



广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆与序列分析

罗六龙1，2，黄冬妮1，2，黄良宗2，马春全2，梁梓森1
（1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.佛山科学技术学院，广东佛山528231）

摘要：为研究广东省猪流行性腹泻病毒S1基因的变异情况，于2012-2013年间从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪样本。通过PCR方法扩增到12个样本的PEDV的S1基因序列，并进行序列比对及遗传分析。结果12个样本PEDV的S1基因序列之间的核苷酸同源性为91.1%～99.6%，氨基酸的同源性为88.5%～99.1%。12个样本PEDV的S1基因序列与国内参考毒株核苷酸的同源性为91.0%～99.9%，氨基酸的同源性为88.5%～99.7%。与国外参考毒株核苷酸的同源性为89.0%～99.7%，氨基酸的同源性为86.5%～99.4%。与经典毒株CV777的核苷酸同源性为91.0%～100.0%，氨基酸的同源性为88.3%～99.9%。其中，仅GD-HY的S1基因与CV777的同源性达100.0%，其他同源性较低。表明近年广东省的PEDV流行毒株以变异株为主，与疫苗株（CV777）的亲缘关系较远。

关键词：猪流行性腹泻病毒；S1基因；序列分析

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由冠状病毒科，冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的猪的一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水和哺乳仔猪高死亡率为基本特征。我国自20世纪80年代以来陆续有本病的报道，2010年底开始，该病的流行区域和流行强度有不断扩大和增强的趋势，给养猪业造成了严重的经济损失［1］。猪流行性腹泻病猪的粪便呈淡黄色或青黄色，体温基本正常，症状的轻重程度随日龄的大小而有所差异，往往日龄越小，症状越严重，病死率越高［3-4］。本研究于2012-2013年间从广东省不同地区猪场采集56份腹泻病仔猪样本进行PEDV检测，从中扩增出12个PEDV的S1基因序列，并对其进行克隆和序列分析。

1　材料与方法

1.1病料采集从广东省发生仔猪腹泻病猪的不同地区不同规模猪场随机采集了56份发病仔猪的小肠样本。仔猪均在1周龄内，发病时间2～5 d不等。

1.2主要试剂TRIZol、DNA Marker（DL-2 000）、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒等，购自TaKaRa公司；氯仿、无水乙醇和异丙醇均为国产分析纯。

1.3引物设计参照GenBank提供的PEDV经典毒株CV777的S基因保守区设计了2对引物［3］，由宝生物工程（大连）有限公司合成。

S1-F：5′-ATTTGTGGCTTTTCTAACA-3′，

S1-R：5′-GCACCACTAGTGACATTCTT-3′；扩增目的片段约为2 107 bp。

1.4病毒总RNA提取取肠道样本经研磨稀释后12 000 r/min（4℃）离心10 min。吸取研磨组织上清液250 μL，加入750 μL的TRIZol，振荡混匀，室温静置10 min。加入200 μL氯仿，混匀后室温静置5 min，12 000 r/min（4℃）离心10 min。缓慢吸取上清600 μL转入1.5 mL EP管中，加入等量异丙醇，-20℃静置20 min，12 000 r/min （4℃）离心10 min，弃上清。加入1 mL的75%乙醇进行洗涤，并于7 500 r/min（4℃）离心15 min，弃上清，超净台干燥20 min，用30 μL DEPC水溶解沉淀，-20℃保存。

1.5S1基因扩增、克隆及测序反应体系如下：PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL，Template RNA 5 μL，RNase Free dH2O up to 50 μL。RT-PCR反应条件为：50℃反转录30 min，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循环35次；72℃终延伸10 min，16℃保存。取5 μL扩增产物于1%琼脂糖进行凝胶电泳进行电泳检测，回收目的片段并连接至pMD18-T载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞，对重组质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，将阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果提交到NCBI BLAST进行验证，应用DNAStar和MEGA 5对获得的12个S1基因序列进行序列分析。

2　结果

被检测的56份肠道样本中有21份阳性样品，阳性率37.5%，从中选出广东省12个不同地区来源的阳性病料进行S1基因扩增，扩增的S1基因片段大小约为2 107 bp（图1）。测序结果获得12个样本PEDV的S1基因序列，命名为：GD-DG、GD-GM、GD-HY、GD-HZ、GD-JM、GD-MM、GDMZ、GD-NH、GD-QY、GD-SS、GD-YC、GD-ZQ。

图1　猪流行性腹泻病毒S1基因的PCR扩增电泳图M：DL-2 000 DNA Marker；1～12：S1基因的RT-PCR扩增产物；13：阴性对照

2.1S1基因的序列变化对12个样本PEDV的S1基因序列与GenBank中登录的部分PEDV的S1基因进行比对分析［2-3］，利用DNAMAN软件对12个样本PEDV的S1基因序列与经典毒株CV777进行比对分析（12个样本PEDV的S基因全长约4 150 bp，本实验扩增到的S1基因长约2 107 bp，编码约700个氨基酸）。结果显示：与经典毒株CV777相比，12个广东病料样本的S1基因的抗原表位区有多处核苷酸位点突变，氨基酸序列分析也显示，被测样本的S1蛋白的抗原表位区有多处氨基酸位点突变，GD-HY、GD-HZ、GD-MM 3个序列与CV777相似度较高，其余9个样本的第84位由Y→H，第86位由D→R，第87、203位由S→G，第89位由Q→H，第120位由I→T，第130位由D→S，第131位由N→I，第138位由V→A，第161位由G→S，第163位由N→H，第164位由I→S，第179位由A→S，第184位由H→Y，第187位由I→F，第197位由R→K，第201位由K→S，第202位由R→G，第203位由S→G，第211位由T→E，其中第160位的D缺失等等。

2.2 S1基因的遗传进化用MEGA 5软件进行系统遗传进化树分析（图2），结果表明：PEDV毒株可分为3个群，而12个广东病料样本的S1基因序列中的9个属于第3群，GD-MM、GD-HZ、GDHY这3个序列则属于第1群。用DNAStar软件对12个样本S1基因序列与参考毒株的S1基因进行核苷酸和氨基酸序列的同源性比较分析，结果显示：12个样本PEDV的S1基因序列之间的核苷酸同源性为91.1%～99.6%，氨基酸的同源性为88.5%～99.1%。12个样本PEDV的S1基因序列与国内参考毒株S1核苷酸的同源性为91.0%～99.9%，其中，GD-YC的S1基因序列与CHS的核苷酸同源性最低，为91.0%，GD-HY的S1基因序列与CH4的核苷酸同源性最高，达99.9%。氨基酸的同源性为88.3%～99.7%，其中，GD-ZQ的S1基因序列与CH4的氨基酸同源性最低，为88.3%，GD-HY的S1基因序列与CH4的氨基酸同源性最高，达99.7%。与国外参考毒株S1基因核苷酸的同源性为89.0%～99.7%，其中，GD-HZ的S1基因序列与Chinju99的核苷酸同源性最低，为89.0%，GD-HZ的S1基因序列与83P-5的核苷酸同源性最高，达99.7%。氨基酸的同源性为86.5%～99.4%，其中，GD-HZ的S1基因序列与Chinju99的氨基酸同源性最低，为86.5%，GD-HY的S1基因序列与AmenutedDR13的氨基酸同源性最高，达99.4%。与经典毒株CV777的S1核苷酸同源性为91.0%～100.0%，氨基酸的同源性为88.3%～99.9%。仅GD-HY的S1基因序列与CV777的核苷酸同源性为100.0%，氨基酸同源性为99.9%。

图2　PEDV的S1基因分子进化树

3　讨论

猪流行性腹泻病毒（PEDV）为单股正链RNA，主要包括S基因、ORF3基因、M基因等，S基因编码PEDV的S蛋白。S蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在免疫反应中有识别靶细胞、使病毒和细胞膜融合的作用［4］。根据冠状病毒I群成员S蛋白S1和S2亚基之间的保守基因序列，PEDV S蛋白可分为两个功能区，即S1和S2［5］，其中S1区包含PEDV主要的中和抗原表位和受体结合域。为研究广东流行毒株S1基因的变异情况，本次研究收集2012-2013年间来自广东不同地区发生仔猪腹泻的猪场粪便样本56份，经RT-PCR方法确定PEDV阳性样本21份，阳性率为37.5%，未检测到TGEV和RV，说明这些猪场的腹泻以PEDV感染为主。

通过PCR方法扩增出12个来自不同猪场的PEDV样本的S1基因。结果表明，在S1基因的抗原表位区，样本序列GD-HZ的第115、118、119、121、138、139、141、144、162、173、181、188位氨基酸由N→D、T→A、N→G、T→V、T→S、A→G、D→G、T→S、G→R、N→S、D→N、F→P；GD-ZQ的第116、190、192、241位氨基酸由G→D、N→H、W→R、A→V；GD-MZ的第116、178、241位氨基酸由G→D、V→I、A→V；GD-QY的第224、247位氨基酸由G→D、T→S；GD-MM的第89位氨基酸由G→S；GD-GM的第127位氨基酸由C→R；GD-JM的第138位氨基酸由T→S；GD-DG的第148位氨基酸由N→K；GD-YC的第255位氨基酸由E→D。这些氨基酸位点的变异均不同于以往毒株，其中GD-HZ毒株的抗原表位区变异位点最多，12个样本PEDV的S1基因之间的核苷酸同源性为91.1%～99.6%，氨基酸的同源性为88.5%～99.1%。这些S1基因变异结果提示，近年广东省的PEDV流行毒株以变异株为主，与疫苗株（CV777）的亲缘关系较远。S基因是PEDV决定抗原表位的主要基因之一，这些变异可能是当前传统疫苗免疫效果不理想的主要原因。同时，该部位基因的变异性较强，变异情况复杂，为今后疫苗免疫防控该病增加难度。未来工作更需重视研究PEDV的变异及生物学作用，将研制变异毒株的高效疫苗作为防治猪流行性腹泻病的重点。

参考文献：

［1］孙东波，冯力，时洪艳，等.猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展［J］.动物医学进展，2006（10）：11-14.

［2］郑逢梅，霍金耀，赵军，等.2010-2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析［J］.病毒学报，2013 （02）：197-205.

［3］Li W，Li H，Liu Y，et al.New variants of porcine epidemic diarrhea virus，China，2011［J］. Emerg Infect Dis，2012，18（8）：1350-1353.

［4］KANG T J，SEO J E，KIM D H，et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of sp ike gene of Porcine ep idemic diarrheavirus and exp ression of its neutralizing epitope in p lants［J］. ProteinExpr Purif，2005，41（2）：378-383.

［5］孙东波.猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选［D］.北京：中国农业科学院.2008.

Cloning and Sequenceanalysis of S1 genes of porcine epidemic diarrhea virus in Guangdong Province

LUO Liu-long1，2，HUANG Dong-ni1，2，HUANG Liang-zong2，MA Chun-quan2，LIANG Zi-sen1
（1.College of Veterinary Medicine，South china Agrversity，Guangzhou 510642，China；2.Foshan University，Foshan 528231，China）

Abstract：To investigate the S1 genetic variation of porcine epidemic diarrhea virus in Guangdong Province，56 piglet diarrhea samples were collected from swine farms in different areas.S1 gene sequences of 12 PEDV strains were amplified by PCR and compared with different strains to analyze the genetic characteristics and evolution regularity .Result showed that the 12 S1 genes shared 91.1%～99.6%nucleotide homology and 88.5%～99.1%amino acid homology.The 12 S1 genes shared 91.0%～99.9%nucleotide homologyand 88.5%～99.1%amino acid homology with Chinese reference strains . The 12 S1 genes shared 89.0%～99.7%nucleotide homology and 86.5%～99.4%amino acid homology with foreign reference strains . The 12 S1 genes shared 91.0%～100.0%nucleotide homology and 88.3%～99.9%amino acid homology with classic strain CV777.Only GD-HY shared 100.0%homology with classic strain CV777，while the rest of the 12 S1genes shared lower homology with CV777.The results implicate that variations of Guangdong PEDV strains have occurred in recent years，and they are distant with CV777.

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；S1 gene；Sequence analysis Corresponding author：MA Chun-quan

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0019- 03

收稿日期：2014-12-29

基金项目：广东省现代生猪产业体系项目；广东高校畜禽疾病诊断防控技术开发中心（GCZX-B1102）；广东省省级科技计划项目（2012B020202002）

作者简介：罗六龙（1991-），男，硕士生，研究方向为兽医病理学，E-mail：395280165@qq.com

通讯作者：马春全，E-mail：machunquan@263.net