江苏地区火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

许金俊，禚振男，郭　平，曲昌宝，刘丹丹，陶建平（1.江苏动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009；2.扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室，江苏扬州225009）



江苏地区火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

许金俊1，2，禚振男1，2，郭平1，2，曲昌宝1，2，刘丹丹1，2，陶建平1，2
（1.江苏动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009；2.扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室，江苏扬州225009）

摘要：从分子水平了解江苏地区火鸡组织滴虫的分类地位与进化特征，以江苏地区感染火鸡组织滴虫发病鸡群的病变肝脏组织为材料，通过DNA提取、PCR扩增、DNA片段的克隆与测序，获得该地区火鸡组织滴虫β-微管蛋白（Betatubulin）序列，通过软件与GenBank收录的其他地区火鸡组织滴虫和相关虫体β-微管蛋白基因序列进行系统发育分析。结果获得的11个火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因序列相互之间同源性在95.3%～100.0%之间，亲缘关系较近，与德国株相似性94.9%以上，与美国株相似性91.6%以上。同时，该地区虫体在基因进化过程中形成2个大的分枝和多个小的分枝。表明江苏地区火鸡组织滴虫存在不同的基因型，应进一步研究其分子流行病学与种群遗传学特征。

关键词：火鸡组织滴虫；β-微管蛋白；同源性；进化关系

禚振男（1989-），女，硕士生，主要从事兽医寄生虫学研究，E-mail：zzn0810@163.com

注：禚振男与许金俊对本文具有同等贡献

组织滴虫病又称“黑头病”，是由火鸡组织滴虫（Histomonas meleagridis）引起鸡形目禽类盲肠和肝脏寄生性机能紊乱的原虫病，以盲肠肿大、肝脏坏死和排硫磺样粪便为主要特征。近年来，随着我国养殖业的不断发展，该病在很多地区有不同程度发生，死亡率达到20%～30%，给养殖业造成了巨大危害。在欧美等发达国家和地区，出于对食品安全方面的考虑，大部分治疗该病的有效药物被禁止使用，使得该病又重新暴发和流行，造成了严重的经济损失。因此，开展火鸡组织滴虫病的研究，对于保障养殖业的健康快速发展具有重要的意义。

微管是组成细胞骨架的重要组分，它存在于所有真核细胞中，是由微管蛋白装配成的长管状细胞器结构。细胞内微管呈网状或束状分布，参与许多细胞的功能，如维持细胞形态、鞭毛和纤毛的运动、染色体运动等［1］。微管又是信号转导和物质运输通道，通过干扰微管形成可影响与凋亡相关的信号转导通路，引起细胞的凋亡［2-3］。因此，针对微管参与细胞的分裂增殖和细胞内物质运输等多种生物学特性，可以设计阻断微管功能的抗微管药物，用于抗肿瘤、抗痛风、抗寄生虫等领域［4］。编码该蛋白的基因相对较为保守，其进化与核子进化是平行的，在寄生虫系统发育分析方面的研究报道则相对较少［5］。

本试验拟对该地区鸡群的火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因进行扩增、测序分析，并与其他地区火鸡组织滴虫和相关虫体β-微管蛋白基因序列进行了系统发育分析，以了解它们之间的遗传和进化关系，为组织滴虫病诊断、分子流行病学调查、种群遗传学研究和药物靶位研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1临床样品用于PCR扩增的11例具有组织滴虫病典型病变的鸡肝组织样品，来源于江苏各地（苏南地区1例，苏中地区6例，苏北地区4例）送至扬州大学附属动物医院就诊的病例，分别标号为HM1～HM11，肝脏采集后于-20℃冰箱冻存。

1.2试剂克隆用载体pGEM-T-Easy，购自Promega公司；宿主菌大肠杆菌DH5α由本实验室保存；DL-2 000 Marker、DNA胶回收试剂盒、LA Taq DNA聚合酶，购自TaKaRa公司；1kb DNA Ladder、25 mmol/L MgCl2、dNTP Mix、DNA聚合酶，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3样品DNA按照酚-氯仿-异戊醇方法提取肝组织DNA，测定浓度后置于-20℃保存备用。

1.4PCR扩增按参考文献［6］设计1对引物扩增Beta-tublin基因：P1，5′-TTC GTA AAG AAG CTG AAT CC -3′；P2，5′-ACG AGG GAA TGG TAC AAG G-3′。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，预期扩增片段大小约为400 bp。25 μL PCR扩增体系为：2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP（10 μmol/L），0.25 μL LA Taq酶，P1、P2引物各2 μL（10 μmol/L），5 μL DNA模板（50 ng/μL），ddH2O 11.25 μL。PCR反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，36个循环，72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察并拍照。

1.5β-微管蛋白基因的克隆及测序在紫外灯下小心切取目的条带，用TaKaRa公司的琼脂糖核酸回收试剂盒纯化目的条带。将纯化产物与pGEM-T-Easy载体常规连接，转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选随机挑取数个单克隆，在LB液体培养基内摇床过夜，碱裂解法抽提质粒，经EcoR I酶切鉴定阳性克隆。将鉴定为阳性的质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.6β-微管蛋白基因序列分析及系统发育树构建采用DNAStar软件，对所获得序列进行同源性分析，并与从GenBank中读取的其他虫体的β-微管蛋白基因序列（表1）进行比对。采用MEGA程序中的最大简约法（MP）绘制系统发育树，并采用自展检验（bootsteap test）估算系统发育树的可靠性。

2　结果

2.1β-微管蛋白基因的PCR扩增结果将扩增后得到的11个样品PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，得到约为400 bp左右的目的条带，目的片段与预期大小相符。图为HM1、HM2、HM3、HM4样品的PCR电泳图，其余样品的扩增结果相同。

2.2PCR产物的克隆及鉴定用纯化回收试剂盒分别回收11个样品的PCR扩增产物并克隆到pGEMT-Easy载体中，每个样品挑取白色菌落碱裂解法提取质粒，EcoR I酶切鉴定。图2为HM1样品：M12345电泳结果，出现3.0 kb的载体片段和M123左右的目的片段（图2），与预计相符。

图2　重组质粒的酶切鉴定结果M：1kb DNA Ladder；1～3：阳性肝脏样品HM1的1号、2号、3号重组质粒

2.3β-微管蛋白基因序列同源性分析经过测序获得的11个β-微管蛋白基因序列均提交到GenBank，登录号分别为KM006029～KM006039。11个基因序列之间及与相似原虫的同源性分析结果见图3。由图3可知：江苏地区火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因序列同源性在95.3%～100.0%之间，与德国株相似性94.9%以上、美国株相似性91.6%以上，与胎儿三毛滴虫相似性在85.6%～83.6%之间，高于鸡四毛滴虫的82.8%～79.6%，巨型艾美耳球虫的68.0%～51.7%和柔嫩艾美耳球虫的67.1%～50.8%。

2.4系统发育分析构建了系统发育树（图4）。系统发育树分析结果表明，江苏地区火鸡组织滴虫向2个方向进化，其与美国株的亲缘关系相对较远。在进化的过程中，HM8与德国株的亲缘关系较近，进化方向基本一致，且较于火鸡组织滴虫其他株的进化是更早的；另一个进化方向中又进一步分化成两个方向，即HM1、HM2、HM6、HM7、HM11的进化是一个方向的，HM3、HM4、HM5、HM9、HM10的进化是一个方向的，可能存在不同的基因型差异。进化树即显示了该地区火鸡组织滴虫的同属关系，又表明了该地区不同虫株的个体差异。同时，该地区火鸡组织滴虫与毛滴虫的关系密切，其进化方向是一致的，而八肋游仆虫的进化更早于其他原虫。

图3　江苏地区与其他地区火鸡组织滴虫及类似原虫的β-微管蛋白基因同源性分析

图4　以β-微管蛋白基因基因序列为分子标记的火鸡组织滴虫的系统发育树

3　讨论

2006年Van der Heijden等利用ITS-1序列的C-profiling技术将火鸡组织滴虫基因型分为I、II型和III型［7］，Hauck等2010年同样利用5.8 S和flanking ITS区域的C-profiling技术将火鸡组织滴虫分为A、B、C、D四个基因型［8］。本研究采用β-微管蛋白基因序列进行系统发育分析，所构建的系统发育树显示，江苏地区鸡源火鸡组织滴虫存在多个不同的分枝，可能存在不同的基因型。中国地域辽阔，家禽饲养量巨大，组织滴虫病流行又非常严重［9］，因此，有必要分离更多的地理株或采集更多的病料，利用分子生物学方法进行系统的鉴定、分类和评定，确定火鸡组织滴虫的基因型和变异情况，为该病的预防和治疗提供一定的理论依据。下一步我们将进一步扩增相关基因，借鉴C-profiling技术在中国火鸡组织滴虫分型方面进行更深入的研究。

本研究对江苏地区的11个β-微管蛋白基因序列分析表明：一方面，江苏不同地区之间以及国外不同株之间的火鸡组织滴虫β-微管蛋白基因序列同源性较高，均在91%以上；另一方面，不同地区间的火鸡组织滴虫基因序列存在一定的差异，这与许金俊等针对18S rRNA基因进行进化分析的结果类似［10］。本研究结果同时表明，同18S rRNA基因一样，微管蛋白基因也是一个研究生物系统发育、分子进化和种群遗传学研究的有效候选靶基因，可以进一步深入研究β-微管蛋白基因及其功能，微管蛋白与药物之间的作用机制，为开发用于控制组织滴虫病的高效安全的新药奠定基础。

参考文献：

［1］Libusova L，Sulimenko T，Sulimenko V，et al.Distinct localization of a beta- tubulin epitope in the Tetrahymena thermophila and Paramecium caudatum cortex［J］.Protoplasma，2005，225（3-4）：157-167.

［2］Giannakakou P，Gussio R，Noqales E，et al.A common pharmacophore for epothilone and taxanes：Molecular basis for drug resistance conferred by tubulin mutations in human cancer cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（6）：2904-2909.

［3］Giannakakou P，Sackett D，Fojo T.Tubulin/Microtubules：Still a promising target for new chemotherapeutic agents［J］.J Natl Cancer Inst，2000，92（3）：182-183.

［4］李建农，蒋建东.微管的生物学特性与药物研究［J］.药学学报，2003，38（4）：311-315.

［5］Zhao Z，Liu H，Luo Y，et al.Molecular evolution and functional divergence of tubulin superfamily in the fungal tree of life［J］.Sci Rep，2014，4：6746.doi：10.1038/srep06746.

［6］Hauck R，Hafez H M.Partial sequence of the beta-tubulin of Histomonas meleagridis and the activity of benzimidazoles against H. meleagridis in vitro［J］.Parasitol Res，2009，104：1183-1189.

［7］Van Der Heijden H M，Landman W J，Greve S，et al. Genotyping of Histomonas meleagridis isolates based on Internal Transcribed Spacer-1 sequences［J］.Avian Pathol，2006，35：330-334.

［8］Hauck R，Balczulat S，Hafez H M.Detection of DNA of Histomonas meleagridis and Tetratrichomonas gallinarum in German poultry flocks between 2004 and 2008［J］.Avian Dis，2010，54（3）：1021-1025.

［9］陈静，陈雪，陶建平，等.动物医院门诊鸡组织滴虫病例的流行病学调查［J］.中国畜牧兽医，2010，37（9）：217-220.

［10］Jinjun Xu，Chanbao Qu，Ping Guo，et al.Phylogenetic Relationships of the 18S rRNA Gene Sequence of Histomonas meleagridis from Chickens in East China［J］.J Anim Vet Adv，2013，12（16）：1338-1342.

中图分类号：S852.72

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）03- 0050- 03

收稿日期：2014-12-02

基金项目：江苏省普通高校专业学位研究生科研实践计划（2014 SJZZ_0185）；江苏省基础研究计划（自然科学基金）面上项目（BK20131229）；扬州大学“新世纪人才工程”项目（2012）；江苏高校优势学科建设二期工程资助项目（2014）；扬州大学科技创新培育基金（2014CXJ053）

作者简介：许金俊（1972-），男，副教授，博士，主要从事兽医寄生虫学教学与科研工作，E-mail：jjxu@yzu.edu.cn