胆宁片对胆汁骨桥蛋白的影响

郭满，陈进宏，张浩，李伟汉

（1.河南省南阳市中心医院，河南南阳473000；2.复旦大学附属华山医院，上海200040）



胆宁片对胆汁骨桥蛋白的影响

郭满1，陈进宏2，张浩1，李伟汉1

（1.河南省南阳市中心医院，河南南阳473000；2.复旦大学附属华山医院，上海200040）

摘要：目的探讨中药胆宁片对胆固醇结石形成的预防作用及机制。方法建立骨桥蛋白（OPN）酶联免疫吸附（ELISA）快速检测法，分别检测正常人群、胆固醇以及胆色素结石患者血清及胆汁中的OPN浓度。另取60例术后诊断为胆固醇结石患者按随机序贯原则等分为胆宁片治疗组、熊去氧胆酸治疗组及对照组。观察胆宁片对患者胆汁OPN浓度的影响。结果胆固醇结石患者血清及胆汁中OPN浓度低于正常人群以及胆色素结石患者（P＜0.05）；胆宁片治疗2周后，胆固醇结石患者血清及胆汁中OPN浓度明显升高（P＜0.05）。结论胆宁片能提高血清和胆汁中抑成核因子OPN的浓度，进而降低患者罹患胆固醇结石的风险。

关键词：胆宁片；酶联免疫吸附；骨桥蛋白

胆汁中胆固醇成核是结石形成的始要环节，研究发现胆汁中存在促/抑成核因子的动态平衡，一旦平衡被打破将导致胆汁中胆固醇析出、结晶进而形成结石［1］。本课题组从前期研究结果中发现，骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）具有抑制胆固醇成核的作用。作者进一步观察中药胆宁片对胆汁抑成核因子OPN浓度的影响，探讨其预防胆固醇结石形成的机制。

1　材料与方法

1.1材料

胆宁片产自上海中药一厂，熊去氧胆酸片产自上海信谊制药总厂，OPN酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自美国R&D公司，辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）购自美国Sigma公司，96孔酶标板及酶标仪购自上海华美公司。

1.2方法

1.2.1建立OPN ELISA标准曲线采用倍比稀释法将包被液纯化的OPN抗体依次加到酶标板中，每孔100μl，37℃包被2 h后，用2%牛血清白蛋白37℃封闭2 h后拍净。将系列稀释度OPN标准品依次加入酶标板孔，每孔100μl，45℃反应1h后拍净。接着每孔加入HRP 100μl（1∶40稀释），37℃反应1 h后每孔加入新鲜酶标底物液100μl，37℃下置暗处15 min，加终止液，取450 nm波长滤光片，于酶标仪上读取每孔光密度值（optical density，OD），建立OPN浓度标准曲线，推导曲线方程。

1.2.2胆石组与正常人群组血清及胆汁OPN含量检测胆固醇结石、胆色素结石和正常人群组各10例，采集血清及术中胆管内胆汁各2 ml。胆石症患者胆汁在肝胆系结石手术时抽取，正常人群组血清及胆汁标本来自于腹部外伤行剖腹探查术患者。本研究中所有标本采集均获得患者知情同意及医院伦理委员会授权。胆汁标本按照Strasberg所述的方法［2］，分装于无菌管中，4℃、15 000 g离心15 min，去除杂质，加入胆汁保存液（0.05%氯霉素、3 mmol/L叠氮钠、1 mmol/L亮抑酶肽和5 mmol/L依地酸钠）置于-80℃冰箱冷冻保存备用。血清及胆汁中OPN浓度采用已建立的ELISA标准曲线计算。

1.2.3实验分组60例胆固醇结石患者按照随机序贯原则分为3组。入选病例为本院2012年6月-2014年6月行胆囊切除并胆管探查术患者，术后均带T管。胆固醇结石分类按肉眼观察及傅氏法。胆宁片治疗组口服胆宁片5片/次，3次/d；熊去氧胆酸片治疗组口服熊去氧胆酸片50 mg/次，2次/d；对照组除采用前两组术后常规治疗外不附加其他任何治疗。前两组患者术后第2天起开始服用药物，共计2周时间，分别于术后1、3、7和14 d采取胆汁和血清，用以上方法测定OPN浓度。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，数据分析用单因素方差分析（组间比较用LSD法）及重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1OPN浓度标准曲线

ELISA法得到标准蛋白系列稀释吸光度，建立曲线方程：Y=0.037X（Y：吸光度；X：OPN浓度mg/mL，相关系数r=0.99）。

2.2ELISA法检测胆石症及正常人群组血清和胆汁中OPN浓度

胆固醇结石组、胆色素结石组和正常人群组血清OPN浓度依次为（41.30±6.46）、（47.50±4.79）和（47.81±7.27）ng/ml，方差齐性检测表明方差齐（P= 0.890），单因素方差分析结果表明组间比较差异有统计学意义（P=0.011）。其中胆固醇结石组患者血清OPN浓度低于胆色素结石组和正常人群组（P= 0.003）；而胆色素结石组和正常人群组OPN浓度比较，差异无统计学意义（P=0.656）。3组患者胆汁检测结果与之相似。见表1。

2.3药物对胆固醇结石患者OPN浓度的影响

重复测量设计方差分析结果显示，3组患者血清和胆汁中OPN浓度比较差异有统计学意义（P= 0.013和0.010）。胆宁片组与对照组血清和胆汁中OPN浓度组间比较，差异有统计学意义（P=0.003和0.004）；而熊去氧胆酸组与对照组血清和胆汁中OPN浓度比较，差异无统计学意义（P=0.570和0.659）。胆宁片组血清和胆汁中OPN浓度随着治疗时间的推移而逐渐升高，时间越长，上升越明显，自服药第7天开始，差异有统计学意义（P=0.009和0.007）。见表2、3。

表1　3组OPN浓度比较（n=10，ng/ml，±s）

表1　3组OPN浓度比较（n=10，ng/ml，±s）

注：1）与正常人群组比较，P=0.003；2）与正常人群组比较，P= 0.656

组别胆固醇结石组胆色素结石组正常人群组血清　　胆汁41.30±6.461）　67.30±9.482）47.50±4.79　79.42±8.71 47.81±7.27　82.20±10.27

表2　胆宁片对血清OPN浓度的影响（n=20，ng/ml，±s）

表2　胆宁片对血清OPN浓度的影响（n=20，ng/ml，±s）

注：1）与第1天比较，P=0.009；2）与第1天比较，P=0.004

组别　　第1天　　第3天　　第7天　　第14天胆宁片组　42.50±7.12 43.18±8.03 46.35±7.531）51.26±6.932）熊去氧胆酸组　41.81±6.65 42.17±6.35 41.57±8.72 42.03±8.52对照组　40.95±7.83 42.05±8.43 41.87±5.85 41.87±7.75

表3　胆宁片对胆汁OPN浓度的影响（n=20，ng/ml，±s）

表3　胆宁片对胆汁OPN浓度的影响（n=20，ng/ml，±s）

注：1）与第1天比较，P=0.007；2）与第1天比较，P=0.002

组别　　第1天　　第3天　　第7天　　第14天胆宁片组　68.37±8.32 72.13±7.75 79.65±9.131）83.50±8.432）熊去氧胆酸组　71.01±7.85 72.67±8.27 70.87±7.82 73.15±7.76对照组　69.75±9.21 71.93±6.49 73.01±6.75 71.80±10.25

3　讨论

胆石症是造成胆道系统急危重症的重要原因。近年来，由于生活方式的改变，我国胆石症的发病率呈逐渐上升趋势，且多为胆固醇性结石［3］，因此研究胆固醇结石成石机制，有效预防和治疗胆固醇结石具有十分重要的理论和现实意义。已有研究表明，胆固醇结石的形成与胆汁促/抑成核平衡体系失调、胆道动力学功能紊乱等因素有关。其中胆汁促/抑成核平衡体系失调造成胆固醇异常成核是结石形成的关键步骤［4］。关于胆汁中促/抑成核因子的研究，现已取得大量的成果。其中促成核因子黏蛋白、α1-酸性糖蛋白、抑成核因子载脂蛋白A1等都已得到学界公认［5-8］。本课题组前期研究中作者观察到，OPN能抑制胆固醇结晶形成，延缓胆固醇结晶出现，并且抑制由钙离子诱导的胆固醇促成核效应，使胆固醇/磷脂泡更加稳定，抑制磷脂泡的动态变化及胆固醇析出，从而降低胆固醇结石的发生［9］。此外，动物实验也证实OPN参与胆囊胆固醇结石形成的整个过程，与其他促成核因子具有拮抗作用［10］。本研究中作者发现，胆固醇结石患者血清及胆汁中OPN浓度明显低于正常人群，且经抗胆结石药物胆宁片治疗后胆固醇结石患者血清及胆汁中OPN浓度明显升高，该结果与笔者前期研究结果发现OPN的抑成核作用相吻合。

胆宁片是由大黄、虎杖、青陈皮等制成的纯中药制剂，具有消炎、利胆、防石、溶石、抗肝脏脂肪变性、改善结石患者胆囊切除术后不适症状等功能［11-12］。研究表明，胆宁片不仅可以提高胆汁中胆盐、磷脂的浓度，促进胆固醇溶解，降低胆汁游离胆红素浓度，改善胆汁成石热力学平衡紊乱［13］；同时动物实验还发现胆宁片还可以上调钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白、多药耐药相关蛋白3、多药耐药蛋白2、谷胱甘肽-S-转移酶A1和葡萄糖醛酸转移酶1A1的表达，有效改善胆汁瘀积，减轻肝胆系病理损害［14］。此外还有研究表明胆宁片可以降低和改变胆汁中33.5 kD泡蛋白等促成核因子含量和结构，从而降低胆汁成核趋势［15］。本研究中作者发现胆宁片可以提高胆石症患者血清及胆汁中抑成核因子OPN的浓度，从而起到溶石和防石的作用。由此认为，胆宁片是一种针对胆结石形成过程的多靶点、多作用机制的有效纯中药制剂。

胆汁中OPN来源目前仍不十分明确。Imano等［16］研究发现，OPN在肝内结石患者的肝内胆管、腺体及结石中都有较强表达。Ichikawa等［17］研究发现，结石患者的胆囊壁有较强的OPN表达，也有较多高表达OPN的巨噬细胞浸润。本课题组前期研究中作者发现［18］，胆囊结石患者的胆囊上皮细胞发生变性，而纤维化或萎缩的上皮细胞表达更多的OPN和整合素，且胆囊结石患者血清OPN浓度较正常人低，胆汁中OPN和钙离子浓度降低。由此笔者认为，胆固醇结石患者体内OPN可能来源于肝脏、胆囊上皮细胞的分泌等途径。胆宁片提高患者体内OPN浓度，初步推测可能与其促进胆系上皮细胞OPN合成相关基因转录及酶类活性等相关，其确切的机制仍有待更深入的研究。

本研究中作者发现3组受试者血清与胆汁中OPN浓度结果一致：即胆固醇结石患者血清及胆汁中OPN浓度明显低于正常人群和胆色素结石患者。由此笔者设想通过ELISA法检测血清中OPN浓度，以帮助筛选易罹患胆固醇结石的高危人群，或为溶石利胆类药物的临床疗效评判提供参考依据，但该设想的可靠性和有效性以及OPN浓度界定位点等仍有待于进一步研究。

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（申海菊 编辑）

Effect of Danning tablets on osteopontin in bile

Man Guo1，Jin-hong Chen2，Hao Zhang1，Wei-han Li1
（1. Nanyang Central Hospital，Nanyang，Henan 473000，China；2. Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract:Objective To investigate the mechanism of Danning tablets in the prevention of cholesterol lithogenesis. Methods A rapid method for detection of anti-nucleating factor osteopontin（OPN）was established. OPN concentrations were detected in serum and bile of the normal group，cholesterol-gallstone group and pigmental-gallstone group. Another group of cholesterol-gallstone patients（n= 60）were randomly divided into Danning group，sodium cholate group and control group；and the changes of OPN in serum and bile were observed using ELISA kits. Results The concentrations of OPN in serum and bile in the cholesterol-gallstone patients were significantly higher than those in the pigmental-gallstone and normal groups（P ＜0.05）. After treatment with Danning tablets for 2 weeks，the serum and bile OPN concentrations significantly increased in the cholesterol-gallstone patients（P ＜0.05）；but this increase was not found in the other two groups. Conclusions Danning tablets can raise the concentrations of anti-nucleating factor OPN in serum and bile，thereby reduce the risk of cholesterol gallstone formation.

Keyword:Danning tablet；enzyme-linked immunosorbent assay；osteopontin

中图分类号：R285；R575.62

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.007

文章编号：1005-8982（2016）07-0029-04

收稿日期：2015-07-05