寻常型天疱疮患者血清骨桥蛋白的检测

索桂英 付萍

寻常型天疱疮患者血清骨桥蛋白的检测

索桂英 付萍

目的 探讨寻常型天疱疮（PV）患者血清中骨桥蛋白在PV发病中的作用。方法 用酶联免疫吸附试验对31例寻常型天疱疮患者和35例健康对照组血清骨桥蛋白的浓度进行测定。用SPSS17.0及Excell统计软件对数据进行处理。结果 PV患者血清骨桥蛋白的表达水平显著高于健康对照组（P<0.01）。皮肤黏膜同时受累患者血清骨桥蛋白水平高于仅皮肤受累组（P<0.05）。合并感染组血清骨桥蛋白水平高于未合并感染组（P<0.01）；PV患者的血清骨桥蛋白水平与抗Dsg3抗体呈正相关（rs=0.489，P<0.01）。结论 骨桥蛋白在PV患者血清中高表达，特别是皮肤黏膜同时受累的患者，且与天疱疮抗体滴度呈正相关。

天疱疮；骨桥蛋白；酶联免疫吸附测定

天疱疮是一组累及皮肤黏膜的自身免疫性大疱病，寻常型天疱疮（PV）约占天疱疮患者的80%［1］。骨桥蛋白是一种带负电荷的分泌型磷酸化糖蛋白，主要由活化的巨噬细胞、白细胞和活化的T淋巴细胞分泌，广泛分布于细胞外液、炎症部位的细胞外基质中。2012年，陈宏等［2］研究骨桥蛋白与大疱性类天疱疮（bullous pemphigoid，BP）的关系，发现BP组的血清骨桥蛋白的表达水平高于健康对照组，并与BP病情活动呈正相关。Baroni等［3］报道，在天疱疮患者血清中可以检测到骨桥蛋白，且骨桥蛋白升高水平与天疱疮循环抗Dsg3/1抗体水平一致，在同时有皮肤和黏膜损害的天疱疮患者中升高更为明显。我们用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定PV患者血清骨桥蛋白水平，探讨骨桥蛋白与PV的关系。

一、对象与方法

1.对象：2011年7月至2013年1月，于昆明医科大学第二附属医院皮肤风湿免疫科住院部确诊的初发或复发活动期PV患者31例（近1个月未规律使用糖皮质激素与免疫抑制剂）。健康对照组35例为同期健康体检者。与PV组患者年龄、性别相匹配。两组对象均抽取清晨空腹外周静脉血3 ml，静置30 min后离心（1600×g，10 min），置于-80℃冰箱中冻存待检。

2.方法：按照人骨桥蛋白ELISA试剂盒（美国RD公司）说明书操作。简要描述如下：将血清样本稀释25倍（10 μl的血清样本加入240 μl的样本稀释液）；向每孔中加入标准品、待测血清样本各50 μl，盖上封板膜，轻摇匀，室温下放置2 h；甩去孔内液体，向每孔中加入约400 μl洗涤液，反应30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作步骤4次。向每孔中加入200 μl的链霉亲和素-HPR，盖上封板膜。向每孔中加入提前配好的显色剂混合液（即显色剂A∶显色剂B=1∶1）200 μl，轻摇匀，室温下避光显色半小时；向每孔中加入终止液50 μl。孔中液体颜色由蓝色变为黄色，未变色的充分混匀；半小时内在酶标仪上450 nm处测定A值；以A值为横坐标，标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并用Excell表格绘制出标准曲线方程。根据血清标本A值，计算出样本浓度，再乘以稀释倍数，即为血清样本的实际浓度。

3.统计学处理：用SPSS17.0及Excell统计软件对数据进行处理，经过SPSS的描述性分析，各组血清骨桥蛋白水平近似正态分布，以±s表示，组间差别采用t检验。对于相关性分析，如果对应两组数据均为正态分布且方差齐，则用Pearson相关分析，相关系数为r。如果对应两组数据有一组不符合正态分布，则采用Spearman秩相关检验，相关系数为rs。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

PV组血清骨桥蛋白水平（49.03±13.43）μg/L高于健康对照组（18.94± 3.89）μg/L，差异有统计学意义（P<0.01）。皮肤黏膜同时受累组血清骨桥蛋白（56.62±25.18）μg/L高于仅皮肤受累组（30.44±19.90）μg/L，差异有统计学意义（P<0.05）。合并感染组血清骨桥蛋白（77.78±27.07）高于未合并感染组（25.34 ± 13.43）μg/L，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

天疱疮组患者的血清骨桥蛋白水平与抗Dsg3抗体呈显著正相关（rs=0.489，P=0.005），与抗Dsg1抗体定量呈正相关（rs=0.383，P=0.033），与补体 C3呈显著负相关（rs=-0.594，P=0.000），与免疫球蛋白 IgG、IgA、IgM，白细胞、红细胞、血小板等无相关性（P>0.05）。

表1 天疱疮各组与健康对照组血清骨桥蛋白水平的比较（x ± s） μg/L

三、讨论

我们的研究发现，31例PV患者血清骨桥蛋白表达水平明显高于健康对照组，皮肤黏膜同时受累的PV患者血清中骨桥蛋白表达水平高于仅皮肤受累的患者，且与抗Dsg1、抗Dsg3抗体滴度呈正相关性。推测可能的机制：骨桥蛋白可通过激活天疱疮发病过程中，自身反应性Th1细胞反应系统，白细胞介素（IL）8能介导局部炎症有关的免疫应答和辅助抗体生成，从而促使天疱疮发生；骨桥蛋白可能通过增强炎症前期的Th1细胞反应，抑制Th2细胞反应的免疫调节作用，发挥对自身免疫性疾病的作用［4］；骨桥蛋白具有刺激T细胞增殖，促进CD44配体的表达和巨噬细胞分泌干扰素γ，IL-12的作用，从而维持B细胞增殖和抗体的产生而发挥作用［5］。有文献报道，天疱疮患者血清前炎性细胞因子肿瘤坏死因子α明显升高，肿瘤坏死因子α能协同天疱疮lgG自身抗体引起表皮棘层松解［6］，而组织损伤和肿瘤坏死因子α均能诱导骨桥蛋白表达，因此，我们不能排除骨桥蛋白升高是继发于表皮损伤或肿瘤坏死因子α升高。骨桥蛋白在天疱疮发病过程中不论是始动因素还是继发性增高，本文结果显示，骨桥蛋白水平随着自身抗体水平的升高而升高，特别是皮肤和黏膜同时受累的患者，提示骨桥蛋白参与了天疱疮的发病过程。

［1］Dick Sarah,Werth Victoria P.Pemphigus:a treatment update［J］.Autoimmunity,2006,39（7）:591-599.

［2］陈宏,赵会娟,门剑龙,等.大疱性类天疱疮患者骨桥蛋白和白介素 18 的检测［J］.中华皮肤科杂志,2012,45（9）:659-661.

［3］Baroni A,De Filippis A,Buommino E,et al.Osteopontin,a protein with cytokine-like properties:a possible involvement in pemphigus vulgaris［J］.Arch Dermatol Res,2012,304（3）:237-240.

［4］O′Regan AW,Nau GJ,Chupp GL,et al.Osteopontin （Eta-1）in cell-mediated immunity:teaching an old dog new tricks［J］.Immunology Today,2000,21（10）:475-478.

［5］Iizuka J,Katagiri Y,Tada N,et al.Introduction of an osteopontin gene confers the increase in B1 cell population and the production of anti-DNA autoantibodies［J］.Lab Invest,1998,78（12）:1523-1533.

［6］Orlov MD,Chernyavsky AI,Arredondo J,et al.Synergistic actions of pemphigus vulgaris IgG,Fas-ligand and tumor necrosis factoralpha during induction of basal cell shrinkage and acantholysis［J］.Autoimmunity,2006,39（7）:557-562.

Detection of serum osteopontin in patients with pemphigus vulgaris

Suo Guiying,Fu Ping*.*Department of Dermatology/Rheumatology,Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China

Fu Ping,Email:cinafuping@hotmail.com

Objective To investigate the role of serum osteopontin in the occurrence of pemphigus vulgaris（PV）.Methods Enzyme-linked immunosorbent assay was conducted to determine serum levels of osteopontin in 31 patients with PV and 35 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest and Spearman rank correlation analysis with the SPSS 17.0 software and Excel.Results Serum levels of osteopontin were significantly higher in patients with PV than in healthy controls （P<0.01）,in patients with mucocutaneous involvement than in those with only cutaneous involvement（P<0.05）,and in patients with complicated infections than in those without（P<0.01）.There was a positive correlation between serum levels of osteopontin and anti-Dsg3 antibody in patients with PV （rs=0.489,P<0.01）.Conclusions Serum levels of osteopontin are increased in patients with PV,especially in those with mucocutaneous involvement,and positively correlated with PV-related antibody titers.

Pemphigus;Osteopontin;Enzyme-linked immunosorbent assay

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.018

云南省应用基础研究（联合专项2012FB059）

650101昆明医科大学第二附属医院皮肤/风湿免疫科［索桂英（现在山东省淄博市中西医结合医院，255026）、付萍］

付萍，Email：cinafuping@hotmail.com

2014-04-09）

（本文编辑：吴晓初）