脂蛋白(a)颗粒水平与早发性冠脉粥样硬化的相关性分析

朱　晶　徐世骥　吴　炯　张春燕　王蓓丽　郭　玮　潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科　上海　200032)

脂蛋白(a)颗粒水平与早发性冠脉粥样硬化的相关性分析

朱晶徐世骥吴炯张春燕王蓓丽郭玮潘柏申△

(复旦大学附属中山医院检验科上海200032)

【摘要】目的探讨血清脂蛋白 (a)[lipoprotein (a),Lp (a)]颗粒水平与早发性冠脉粥样硬化的相关性,研究以nmol/L为检测单位的Lp (a)试剂的临床应用价值。方法检测177名早发性冠脉粥样硬化患者和200名体检健康者 (对照组)的血清Lp (a)颗粒水平,将检测结果与患者冠脉粥样硬化程度 (以Gensini积分评估)和其他血清标志物进行相关性分析。结果该Lp (a)试剂的检测精密度在可接受范围内,浓度在2.65～235.20 nmol/L的线性验证良好。在早发性冠脉粥样硬化组中有35.51% 的患者Lp (a)颗粒水平升高,该比例显著高于对照组的4% (P<0.001)。Lp (a)、胆固醇 (cholesterol,CHO)、载脂蛋白B (apolipoprotein-B,APO-B),肌酐 (creatinine,CRE)、高敏C反应蛋白 (high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)与早发性冠脉粥样硬化严重程度呈显著正相关 (P<0.05)。通过二元Logistic回归分析得到,Lp (a) (OR=2.883,P=0.004)与APO-B (OR=5.440,P=0.007)是早发性冠脉粥样硬化严重程度的独立风险因素。结论以nmol/L为检测单位，Lp (a)试剂的精密度和线性范围均符合实验室检测性能要求,适合于临床检验应用。血清Lp (a)颗粒水平是早发性冠脉粥样硬化严重程度的独立风险因子,可预测早发性冠脉粥样硬化的严重程度。

【关键词】脂蛋白(a);早发性冠脉粥样硬化;检测性能验证

心血管疾病是全球范围内死亡率最高的疾病,其中冠状动脉粥样硬化性心脏病 (简称冠心病)最为常见。全球每年约720万人死于冠心病,25%的成年人初发心脏病即被夺去生命[1]。近年来我国冠心病的发病也呈现出年轻化的趋势。目前认为，男性≤55岁、女性≤65岁,至少有一支冠状动脉主干或其主要分支内径狭窄≥50%即可认定为早发性冠脉粥样硬化[2]。应用实验室检测标志物对于辅助诊断和预测早发性冠脉粥样硬化具有重要的意义。

大量研究证实,脂蛋白 (a)[lipoprotein (a),Lp (a)]与冠心病密切相关,Lp (a)是预测冠心病的独立风险因素[3]。在欧洲动脉粥样硬化学会2010年导则中推荐高危人群应检测Lp (a)。但由于Lp (a)不同亚型之间分子大小存在高度异质性,Lp (a)检测方法的标准化一直是重要课题。在国际临床化学和实验室医学联盟 (International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine,IFCC)的推动下,Lp (a)的检测标准化工作取得了较大成绩,目前已基本构建了Lp (a)的标准化检测体系。同时为了解决Lp (a)分子大小异质性的问题,IFCC推荐以nmol/L为检测单位报告Lp (a)颗粒水平[4]。

目前我国临床使用的Lp (a)检测试剂多以mg/L为报告单位,无法反映Lp (a)分子颗粒大小的异质性。本文首次评估了可溯源至IFCC标准的罗氏Lp (a)试剂的检测性能,并研究了Lp (a)颗粒水平在早发性冠脉粥样硬化患者中的临床应用价值。

资 料 和 方 法

研究对象

早发性冠脉粥样硬化组选择2014年1月至4月入院行冠状动脉造影术并诊断为早发冠脉粥样硬化的患者177名,年龄25～65岁,平均年龄49.1岁,其中男性153名,女性24名。排除标准: (1)肝和/或肾功能不全; (2)影响脂质代谢的其他疾病,如甲状腺功能减低、肾病综合征等。经冠状动脉造影证实,至少有一支冠状动脉主干或其主要分支内径狭窄≥50%,男性≤55岁、女性≤65岁诊断为早发冠脉粥样硬化。

对照组选择本院体检健康者,经 B超、心电图、临床各项检查及血糖、肝肾功能等检验排除肝病、肾病、冠心病、高血压、肿瘤、糖尿病等病史和疾病,匹配疾病组年龄,入组200名,年龄26～65岁,平均年龄48.2岁,其中男性157名,女性43名。入选对象均空腹12 h后于次日清晨,经肘静脉采血3 mL,加入内含惰性分离胶、促凝剂的真空采血管中,以3 500×g离心10 min,分离血清,-80 ℃保存待检。

仪器和试剂Lp (a)2试剂盒 (681357-01,瑞士Roche公司),Lp (a)试剂盒 (471681,日本积水公司)在全自动生化分析仪 (cobas c501,瑞士Roche公司)上检测;胆固醇 (600265,瑞士Roche公司)、肌酐 (600108,瑞士Roche公司)、血糖 (693978,瑞士Roche公司)、低密度脂蛋白胆固醇 (596ADB,日本KYOWA公司)、载脂蛋白A (18550/00001094)、载脂蛋白B (18560/00001096)、hs-CRP (60090303,德国Diasys公司)在HITACHI 7600全自动生化分析仪上检测。

性能验证

精密度收集临床患者混合血清,分为Lp (a)高、中、低水平各进行20次重复检验,计算批内精密度。高、中、低水平连续检验20天,计算批间精密度。结果以均值、标准差和变异系数 (CV)表示,根据文献[5],不精密度不大于±4%认为可接受。

线性范围验证选取Lp (a)高值和低值标本,两者以不同比例做系列稀释,配制成5个不同浓度的混合血清。每一混合血清重复检测2次,取其均值为实测值。以理论值为X轴,实测值为Y轴,得到回归方程:Y=bX+a,并计算相关系数。若b在1±0.03,a与0无显著性差异,则认为线性范围可接受。

试剂间相关性验证共收集Lp (a)浓度为2.65～235.2 nmol/L的血清标本377例,分别使用罗氏试剂 (nmol/L)和积水试剂 (mg/L)检测,以罗氏试剂检测结果作为X轴,积水试剂检测结果作为Y轴,得到回归方程：Y=bX+a,并计算出相关系数,比较两种试剂间的相关性。

Lp (a)在早发性冠脉粥样硬化中的临床应用检测早发性冠脉粥样硬化组与对照组人群的Lp (a)颗粒水平,比较两者的分布差异。根据Framingham研究,将75 nmol/L作为Lp (a)判断限[4],将早发性冠脉粥样硬化患者分为Lp (a)≤75 nmol/L组与>75 nmol/L,对两组的临床资料进行比较。

比较早发性冠脉粥样硬化程度严重组和轻微组的临床资料,根据Gensini积分系统来评价冠状动脉造影术结果，判断心血管疾病严重程度,此积分系统结合了冠状动脉病变部位和狭窄程度。Gensini积分>30为阻塞严重,Gensini积分≤30为阻塞轻微[6]，对两组的临床资料进行比较。

Lp (a)与早发性冠脉粥样硬化程度的相关性和独立风险因素分析分析早发性冠脉粥样硬化组中Lp (a) 水平与年龄、性别、Gensini积分、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A、载脂蛋白B、肌酐、血糖、超敏CRP的线性相关程度。以Gensini积分>30作为因变量,以其他风险因素作为自变量;进一步以Lp (a)≤75 nmol/L组与Lp (a)>75 nmol/L组作为自变量。以二元Logistic逐步回归法分析Lp (a)是否为Gensini积分>30的独立风险因素。

结果

Lp(a)试剂性能验证

精密度验证高、中、低水平Lp(a)混合血清不精密度结果见表1,CV水平均≤4%。

表1　不同水平Lp (a)的批内和批间精密度

线性验证使用Lp (a)混合血清进行线性范围验证,浓度在2.65～235.2 nmol/L线性良好,实测均值与理论值的线性方程为y=1.021 4x-7.087 7 (R2=0.996 8)，基本涵盖了厂商说明书中声明的7～240 nmol/L线性范围。

试剂间相关性验证共收集Lp (a)浓度在2.65～235.2 nmol/L的血清标本377例,分别使用罗氏试剂 (nmol/L)和积水试剂 (mg/L)检测,比较检测结果的相关性 (图1),两类试剂间存在良好的相关性,线性方程为y=3.526x+6.438 (R2=0.975)。

Lp(a)在早发性冠脉粥样硬化中的应用

早发性冠脉粥样硬化组与对照组的Lp (a)颗粒水平比较早发性冠脉粥样硬化组Lp (a)颗粒水平高于对照组,两组均值差异有显著统计学意义 (P<0.001，图2A)。以75 nmol/L作为Lp (a)判断限,早发性冠脉粥样硬化组中35.51%的患者Lp (a)颗粒水平升高,而这一比例在对照组中为4.00%,前者显著高于后者 (图2B)。

Lp (a)颗粒水平分布情况 (图2A)：对照组中位数 (四分位间距)为13.7 (28.08);早发性冠脉粥样硬化组中位数 (四分位间距)为37.0 (81.85)，两组间Lp (a)颗粒水平分布差异有显著统计学意义 (P<0.001)。

早发性冠脉粥样硬化患者Lp(a)≤75 nmol/L组与>75 nmol/L组的临床资料比较将早发性冠脉粥样硬化组分为Lp (a)≤75 nmol/L组与>75 nmol/L组,对两组间临床资料进行比较 (表2)。两组间Gensini积分、CHO水平、Apo-B水平差异有显著统计学意义 (P<0.001)。

表2　早发性冠脉粥样硬化患者Lp (a)≤75 nmol/L组与

aData cannot be converted to normal distribution,expressed as median (quartile),and analysed byMann-WhitneyUtest.bNormal distribution data are analysed by independent-samplesttest.

早发性冠脉粥样硬化患者Gensini积分≤30组与>30组的临床资料比较根据Gensini积分将早发性冠脉粥样硬化组分为Gensini积分≤30组 (硬化程度轻微)与>30组 (硬化程度严重),比较两组间临床资料 (表3)。两组间Lp (a)颗粒水平及Lp (a)升高百分比的差异有显著统计学意义 (P<0.001,图3)。

Lp (a)颗粒水平分布情况 (图3A):Gensini积分≤30组的中位数 (四分位间距)为20.4 (46.7);Gensini积分>30组的中位数 (四分位间距)为59.1 (95.83)，两组间Lp (a)颗粒水平差异有显著统计学意义 (P<0.001)。

以75 nmol/L作为Lp (a)判断限,Gensini积分>30组中有43.33% Lp (a)颗粒水平升高,Gensini积分≤30中有17.24% Lp (a)颗粒水平升高,Gensini积分>30组中阳性百分比显著高于Gensini积分≤30 (图3B)。

Lp (a)与早发性冠脉粥样硬化严重程度的相关性及Lp (a)是否为其独立影响因素分析早发性冠脉粥样硬化严重程度与各种危险因素的相关程度(表3),其中将Lp (a)为75 nmol/L作为判断限分为两组。结果显示Lp (a),CHO,APO-B,CRE,hs-CRP与冠脉粥样硬化严重程度呈显著正相关性 (P<0.05)。为了进一步排除混合因素的影响,通过二元逐步回归分析10种风险因素与冠脉粥样硬化分组相关情况,以P<0.05进入、P>0.1剔出模型,结果显示Lp (a) (OR=2.883,95% CI:1.400～5.939,P=0.004)与APO-B (OR=5.440,95% CI:1.574～18.804,P=0.007)是冠脉粥样硬化严重程度的独立风险因素。

表3　早发性冠脉粥样硬化患者Gensini积分≤30组

aData cannot be converted to normal distribution,expressed as median (quartile) and analysed byMann-WhitneyUtest.bNormal distribution data,analysed by independent-samplesttest.

讨论

Lp (a)无法精确检测质量的主要难度在于其结构,Lp (a)中Apo (a)分子具有的高度多态性,Apo (a)环饼区域K4的第2段中的重复差异从3～40个拷贝不等,这使得Apo (a)的相对分子质量从187 000到662 000,直接导致不同型Lp (a)大小存在巨大差异[7]。以mg/L为检测单位报告Lp (a)质量，评估心血管风险中会存在过高或过低评估[8]，比如不同待测样本可能得到相同的分子总质量结果,但由于Lp (a)分子大小的异质性,Lp (a)微粒的总数量可能会存在较大的差异。研究发现Lp (a)的绝对分子数量水平对心血管疾病的风险预测能力远高于Lp (a)颗粒大小情况[9]。使用nmol/L为检测单位报告的Lp (a)微粒的总数量更能准确地预测心血管疾病的风险情况。IFCC推荐以nmol/L报告Lp (a)颗粒水平,不推荐以mg/L报告,因为以nmol/L报告更利于不同方法测定的Lp (a)和不同研究中Lp (a)的可比性[4]。

以nmol/L为单位报告Lp (a)必须满足两个条件:Lp (a)检测抗体避免受到Apo (a)多态性的影响,Lp (a)校准品可溯源至IFCC参考物质。本研究中使用罗氏Tina-quant®Lp (a)二代试剂检测抗体,可识别每一分子的apo (a),并且可溯源至IFCC参考物质SRM2B (nmol/L)。该试剂遵照欧洲动脉粥样硬化学会 (EAS)指南,采用nmol/L报告单位,性能验证结果显示良好的重复性及线性。并且与积水试剂 (mg/L)进行方法学比对,结果显示两者相关性良好。

冠心病是一类与年龄密切相关的疾病,高龄是冠心病的重要危险因素。早发冠状动脉粥样硬化性心脏病患者发病早,社会危害更大。高龄冠心病的危险因素主要是胆固醇、糖尿病等,早发冠状动脉粥样硬化性心脏病的危险因素与之存在差异,目前普遍认为其更倾向于遗传背景。本研究比较了Lp (a)水平在早发性冠脉粥样硬化组与对照组中的差异,疾病组中Lp (a)颗粒水平明显升高。以75 nmol/L作为Lp (a)的判断限,疾病组中Lp (a)颗粒水平升高的比例远高于对照组。进一步分析冠脉粥样硬化严重程度与Lp (a)的关系,根据冠状动脉造影Gensini积分系统评估冠状动脉粥样硬化的严重程度,比较Lp (a)等10种风险因素与冠状动脉粥样硬化严重程度间的关系,结果显示阻塞程度严重组的LP (a)、CHO、Apo-B、CREA、hs-CRP水平和男性比例高于阻塞程度轻微组。为了进一步排除混合因素的影响,本研究通过二元逐步回归分析10种风险因素与冠脉粥样硬化分组相关情况,结果显示Lp (a) (OR=2.883,P=0.004)与Apo-B (OR=5.440,P=0.007)是冠脉粥样硬化严重程度的独立风险因素,在Lp (a)>75 nmol/L的患者中,冠脉粥样硬化的情况更严重。本研究结果证明Lp (a)可以用于预测早发性冠脉粥样硬化患者的严重程度,为临床观察和治疗早发性冠心病患者提供指导。

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The correlation analysis between lipoprotein (a) levels and early coronary atherosclerosis

ZHU Jing, XU Shi-ji, WU Jiong, ZHANG Chun-yan, WANG Bei-li, GUO Wei, PAN Bai-shen△

(DepartmentofClinicalMedicine,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the relationship between serum lipoprotein (a)[Lp (a)] level and early coronary atherosclerosis,and to validate the clinical application when using nmol/L as the unit of Lp (a).MethodsSerum Lp (a) level were dected in 177 patients with early coronary atherosclerosis who underwent angiography and 200 healthy individuals (the control group).The correlation was analyzed between Lp (a) level and the severity of coronary artery disease,and between Lp (a) level and other biomarkers using Gensini Integrals.ResultsThe detection imprecision of Lp (a) reagent's was in the acceptable range,and it was linear in the studied range of 2.65-235.20 nmol/L.The proportion of elevated serum Lp (a) level was significantly higher in the atherosclerosis group (35.51%) compared with the control group (4%) (P<0.001).Spearman’s correlation analysis indicated that serum Lp (a),cholesterol (CHO),apolipoprotein-B (APO-B),creatinine (CRE),and high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) levels were positive correlated with the severity of early coronary atherosclerosis (P<0.05).Binary Logistic regression analysis demonstrated that serum Lp (a) and APO-B levels were significantly independently associated with the severity of coronary atherosclerosis (OR=2.883,P=0.004 and OR=5.440,P=0.007,respectively).ConclusionsLp (a) reagent is reliable for laboratory test in precision and linear studies.When using nmol/L as the unit,Lp (a) is an independent risk factor for early coronary atherosclerosis,and could predict its severity.

【Key words】lipoprotein (a);early coronary atherosclerosis;performance evaluation

【中图分类号】R543.3

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.004

(收稿日期:2015-10-13;编辑:王蔚)

国家自然科学基金面上项目 (81572064);“十二五”国家科技支撑计划课题 (2012BAI37B01);上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目 (2015ZB0201)

△Corresponding authorE-mail:pan.baishen@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81572064),the National Science & Technology Pillar Program during the 12thFive-year Plan Period (2012BAI37B01) and the Key Developing Disciplines of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2015ZB0201).