神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的实验研究

张东利黑龙江省医院急救中心，黑龙江哈尔滨　150000



神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的实验研究

张东利
黑龙江省医院急救中心，黑龙江哈尔滨150000

［摘要］目的研究神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的临床效果。方法选择年龄在12个月左右的60只健康成年Wistar大鼠作为该次实验对象，实验时间为2015年5—10月，大鼠的体重均在300～400 g左右，用于制备血管性痴呆2VO模型，将大鼠随机分成3组，分别为假手术组、对照组及NSCs组，在移植前后对3组大鼠实施Morris水迷测试。结果移植后5周、10周时，NSCs组大鼠逃避潜伏期（36.85±7.14）、（40.26±8.11）相对于对照组（52.11±6.57）、（54.10± 7.16）有了显著的减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论针对VaD大鼠模型采用神经干细胞移植的效果显著，能有效改善大鼠学习记忆能力。

［关键词］神经干细胞移植；血管性痴呆；实验研究

血管性痴呆是指由出血性卒中、缺血性卒中及造成认知、行为及记忆等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征，主要发生原因与脑缺氧、出血性病变、感染因素、家族史及其他因素有关，临床症状主要表现为焦虑、眼花、猜疑、认知功能障碍及易激惹等，严重影响患者的生活质量，增加患者家庭的经济及精神负担，若不及时治疗，将会导致抑郁症、自主神经功能紊乱及肺部感染尿路感染等疾病出现。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择年龄在12个月左右的60只健康成年Wistar大鼠作为该实验对象，实验时间为2015年5—10月，大鼠的体重均在300～400 g左右，用于制备血管性痴呆2VO模型，将大鼠随机分成3组，分别为假手术组、对照组及神经干细胞移植组，每组各20只，假手术组大鼠月龄为10～15个月，平均月龄为（12.50±1.31）个月，体重300～450 g，平均体重为（385.12±25.64）g；对照组大鼠月龄为10～14个月，平均月龄为（12.38±1.29）个月，体重300～420 g，平均体重为（385.10±25.38）g；神经干细胞移植组大鼠月龄为10～13个月，平均月龄为（12.23± 1.28）个月，体重300～410 g，平均体重为（383.10±25.10）g。对比3组大鼠临床资料发现，差异无统计学意义（P＞0.05），组间具有可比性。

1.2 方法

对照组20只在模型建立成功后一个月海马立体定位注射10 uL生理盐水。NSCs组在VaD模型造模成功后1个月海马立体定位注射10 uL NSCs液。进行原代培养Wistar大鼠神经干细胞球，传代至第6代后，将慢病毒介导GFP转染后移植备用。给予10%水合氯醛进行麻醉，剔除颈部毛发，将颈部皮肤充分暴露，常规消毒，于胸骨上方正中处作一2 cm左右的切口，将皮下组织、肌肉钝性分离，充分暴露神经、血管，将迷走神经及颈总动脉采用玻钩进行分离，于颈总动脉上1/3处用手术线在近心端与远心端结扎，阻断血流，离断颈总动脉，在结扎另一侧颈总动脉，撒上头孢唑林钠粉，避免感染现象，最后缝合伤口，注射头孢唑林钠。

假手术组采用常规麻醉后，切开皮肤，将双侧颈总动脉暴露出来，无需结扎血管，海马立体定位注射10ul生理盐水。假手术组手术方式与NSCs组一致，但注意其对双侧颈动脉不实施结扎操作；常规麻醉后，NSCs组在VaD模型造模成功后1个月海马立体定位注射10 uL NSCs液，在注射点相应颅骨上钻孔，吸入15 uL待移植细胞，在海马内注射NSCs液，一侧注射量为5 uL，将注射速度控制在1 uL/min内，留针5 min，采用明胶海绵将颅孔进行封闭，最后缝合皮肤。移植1周后，将NSCs组及对照组大鼠处死并迅速将其大脑取出，进行冰冻切片，在荧光显微镜下对大脑切片海马区进行观察。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0软件对3组Wistar大鼠的各项观察指标情况进行统计学处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，并采用t检验，计数资料采用（n，%）表示，采用X2检验。

2 结果

神经干细胞通过海马立体注射后7 d，NSCs组大鼠海马区冰冻切片呈现绿色荧光出现，对照组大鼠脑组织切片在镜下未出现荧光，由此可知，神经干细胞移植7 d后，在海马区域存在存活及增殖现象。移植后5周、10周时，NSCs组大鼠逃避潜伏期相对于对照组有了显著的减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；NSCs组穿越平台区次数相对于对照组有明显的增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；但相对于假手术组各种观察指标的差异，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 对比3组大鼠逃避潜伏期(±s）

表1 对比3组大鼠逃避潜伏期(±s）

注：假手术组与对照组：T移植前=16.716，P=0.000；T移植1周= 12.119，P=0.000；T移植2周=15.048，P=0.000；T移植10周=13.183，P= 0.000；NSCs组与对照组：T移植前=0.245，P=0.8077；T移植1周=5.568，P=0.000；T移植5周=7.034，P=0.000；T移植10周=5.721，P=0.000；假手术组与NSCs组：T移植前=17.627，P=0.000；T移植1周=7.675，P=0.000；T移植5周=6.647，P=0.000；T移植10周=6.239，P=0.000。

假手术组（n=20）对照组（n=20）NSCs组（n=20）组别20.13±5.58 50.16±5.78 49.74±5.03移植前21.36±6.24 49.63±8.36 36.59±6.31移植1周23.58±5.36 52.11±6.57 36.85±7.14 25.89±6.35 54.10±7.16 40.26±8.11移植5周　 移植10周

3 讨论

尼氏体属于胞质内一种嗜碱性物质，常见于各种神经元内，是神经元的特征性结构之一［1］，其主要功能是为机体合成蛋白质，染色后呈现蓝紫色，常用于显示脑或脊髓的基本神经结构，尼氏体数量较多说明神经细胞合成蛋白质的功能较强，神经细胞受损时，尼氏体数量减少，甚至消失［2］。移植神经干细胞的方式主要包括尾静脉注射、脑实质立体定向注射、腰穿蛛网膜下腔注射、颈动脉注射等［3］，动脉注射具有一定的优势，动脉移植途径细胞经由颈外动脉注射入梗塞侧颈内动脉，随着血流分布于患侧大脑内，具有较高的细胞浓度［4］。

大脑边缘系统主要为海马，大脑皮层的功能区参与了空间参考记忆存储［5］，海马是记忆存储的重要结构，能将短时记忆转化为长时记忆，而后进行记忆巩固，海马对于缺氧缺血敏感性较高［6］，一旦大脑出现缺氧及缺血，海马区的神经元会出现坏死现象，导致认知功能发生障碍，对大鼠海马立体注射慢病毒介导GFP标记后及NSCs，在切片固定后将荧光显微镜倒置观察到存在大量移植后干细胞在海马区存活［7］。胡兰兰等［8］在骨髓间充质干细胞输注对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的影响一文中指出：“海马CA1区神经细胞出现凋亡，直接影响信息的回忆及贮存，导致学习记忆功能出现障碍，若能保护大鼠海马神经细胞，减少脑组织凋亡细胞的比例，就能起到保护因缺血、缺氧引起的学习及记忆能力减退现象。”这一研究结果与该文一致。文章中主要对细胞移植对VaD大鼠学习记忆的影响进行了观察，结果得出：术后8周治疗组评分（70.6±4.7）%明显优于模型组（43.6±3.6）%，，两组术前评分（91.1±4.4）%、（92.5±5.3）%不存在差异，术后2周、术后4周及术后8周均存在显著差异（P＜0.05）；与该文中的实验结果相符。

综上所述，神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的临床效果明显，能有效改善及提高血管性痴呆大鼠学习记忆能力，保护脑内与学习记忆紧密相关的海马神经元。

［参考文献］

［1］孙桂芳.神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的研究［D］.郑州：郑州大学，2014.

［2］胡兰兰，姚永杰，苏长雨，等.骨髓间充质干细胞输注对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的影响［J］.中华老年心脑血管病杂志，2014，16（11）：1212-1214.

［3］李丽杰.骨髓间充质干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的实验研究［D］.天津：天津医科大学，2011.

［4］井沆，肖雁，官志忠，等.骨髓间充质干细胞移植至血管性痴呆大鼠模型的初步研究［J］.贵阳医学院学报，2014，39（2）：148-153，161.

［5］陈志.骨髓间充质干细胞移植对血管性痴呆模型大鼠脑源性神经生长因子的影响［D］.南宁：广西医科大学，2010.

［6］农伟东，莫雪安，阳玉群，等.甘露醇对骨髓间充质干细胞治疗血管性痴呆大鼠行为学及海马CA3区突触素表达水平的影响［J］.中华神经科杂志，2013，46（6）：408-413.

［7］马向薇.胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病［J］.中国组织工程研究，2013，16（31）：5717-5722.

［8］胡兰兰，姚永杰，苏长雨，等.骨髓间充质干细胞输注对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的影响［J］.中华老年心脑血管病杂志，2014，16（11）：1212-1214.

Experimental Research of Neural Stem Cells Transplantation？in Treatment of Rats with Vascular Dementia

ZHANG Dong-li
UCC，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150000 China

［Abstract］Objective To research the clinical effect of neural stem cells transplantation in treatment of rats with vascular dementia. Methods 60 healthy adult Wistar rats whose weight were between 300～400 g and whose ages were about 12 months were selected as the experimental object，and the experimental time was from May 2015 to October 2015，and they were used to prepare vascular dementia 2VO models and randomly divided into the sham-operated group，control group and NSCs group，and the three groups were tested by Morris water maze task before and after transplantation. Results The escape latent periods of rats in the NSCs group obviously decreased at the 5 weeks and 10 weeks after transplantation compared with those in the control group with statistical significance［（36.85±7.14），（40.26±8.11）vs（52.11±6.57），（54.10±7.16）］（P＜0.05）. Conclusion The effect of neural stem cells transplantation for VaD rat models is prominent，which can effectively improve the learning and memory abilities of rats.

［Key words］Neural stem cells transplantation；Vascular dementia；Experimental research

［中图分类号］R749.13

［文献标识码］A

［文章编号］1674-0742（2016）04（a）-0056-02

［作者简介］张东利（1979.5-），男，黑龙江人，本科，主治医师，主要从事神经内科血管性痴呆方面疾病的诊治工作。

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.10.056

收稿日期：（2016-01-03）