Trpm7下调对大鼠心肌细胞游离Ca2+浓度影响的研究

赵洪侠　李发恩



Trpm7下调对大鼠心肌细胞游离Ca2+浓度影响的研究

赵洪侠李发恩

【摘要】目的TRPM7是心肌细胞内一种阳离子通道，对Mg2+和Ca2+都具有通透性。为了深入研究TRPM7基因在心肌细胞的功能，本试验试图研究下调TRPM7后大鼠心肌细胞内Ca2+浓度的变化。方法大鼠心肌细胞的原代培养，心肌细胞存活度的测定，小干扰RNA(siRNA)技术，大鼠心肌细胞胞内游离Ca2+荧光强度的检测。结果经过胞内游离Ca2+荧光强度的检测发现下调TRPM7后大鼠心肌细胞内Ca2+浓度无显著变化。 结论调TRPM7后对心肌细胞钙的代谢没有显著影响。

【关键词】TRPM7siRNA胞内游离Ca2+浓度心肌细胞

TRPM7(transient receptor potential melastatin 7)是一种具有离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能蛋白, 近年来主要研究TRPM7作为哺乳动物细胞胞内Mg2+调控通道蛋白作用。TRPM7不仅仅是对Mg2+的通透不可或缺，其对Ca2+的调节也具有重要作用。目前大量的研究显示TRPM7对细胞的生存有重要的功能，在细胞水平，TRPM7调节淋巴细胞、神经细胞和肥大细胞的存活[1～3]。在敲除鸟类B淋巴细胞TRPM7基因后，细胞对Mg2+的摄取发生障碍，失去生长能力，存活期也大大缩短，而重新转入TRPM7基因后异常现象得以纠正[4]。研究显示TRPM7成为氧糖剥夺神经元损伤过程中引起非谷氨酸依赖性的钙超载的重要分子[2]。本试验应用siRNA技术下调大鼠乳鼠心肌细胞上TRPM7，观察下调TRPM7对大鼠心肌细胞内游离钙离子浓度的影响，为深入研究心肌细胞中TRPM7的功能及心肌细胞中TRPM7与Mg2+关系奠定基础，为相关心脏疾病发病机制的研究提供更多的试验依据。

1.材料和方法

1.1材料1天SD大鼠购于南通大学试验动物中心; TRPM7siRNA购于上海吉玛公司; siRNA转染试剂购自Invirgen公司;calcium-Indo 1-AM购于美国Invitrogen公司。

1.2试验方法和步骤

1.2.1心肌细胞的原代培养：选择10只出生1天左右的SD大鼠，在超净台内消毒后取出心脏剪下心尖部分，剪碎心尖放于装有胰酶和Ⅰ型胶原酶混合物的小瓶内，37℃震荡消化后收集心肌细胞，反复几次后将得到的心肌细胞移到培养皿中，24小时后进行心肌细胞存活度检测。

1.2.2siRNA转染技术： 将脂质体转染试剂与siRNA充分结合，25分钟后将混合液加入到培养24小时的心肌细胞培养皿中，60小时后再进行后续试验。

1.2.3大鼠心肌细胞胞内游离Ca2+荧光强度的检测：将calcium-indo-1的终浓度用孵育液稀释到3μM，然后孵育细胞30分钟，重复一次后测量荧光强度。镁离子荧光探针calcium-indo-1的荧光强度的变化代表胞内游离Ca2+浓度的变化，本试验数据的统计是应用Image J软件对细胞荧光强度进行半定量分析。

2.结果

2.1大鼠心肌细胞存活度的检测原代大鼠心肌细胞培养完成后，接种前用台盼蓝染色法测定细胞存活度。将细胞悬液与1%的台盼蓝溶液以1:1的比例混合均匀滴入细胞计数板，于3分钟内在显微镜下计数，分别计数活细胞和死细胞，无色透明状的为活细胞，染成蓝色的为死细胞。点数400个细胞，着色细胞数量为26个，细胞存活率为374/400×100%=93.5%。

A为空白对照；B为NC siRNA对照组；C为trpm7 siRNA试验组；D为转染trpm7 siRNA 48小时后心肌细胞内游离Ca2+荧光强度数据统计图；E为转染trpm7 siRNA 60小时后心肌细胞内游离Ca2+荧光强度数据统计图。图1　trpm7 siRNA转染大鼠心肌细胞48小时和60小时后细胞内Ca2+ 变化图

2.2大鼠心肌细胞胞内游离Ca2+荧光强度的检测用calcium-indo-1孵育细胞后测量荧光强度。结果显示(图1)，trpm7 siRNA转染大鼠心肌细胞48小时和60小时后，胞内游离Ca2+荧光强度分别升高3%(P>0.05)和降低5%(P>0.05)，即胞内游离Ca2+浓度没有显著变化。

3.讨论

Ca2+是哺乳动物细胞内重要的二价阳离子之一，Ca2+的代谢对机体各项生命活动有着重要的作用，它是维持细胞各项功能所必需的。TRPM7是一种具有离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能蛋白，作为一种非选择性阳离子通道，TRPM7可通透多种单价、二价阳离子，研究显示Mg2+通过TRPM7通道流入细胞会导致胞内Ca2+水平改变，并引起各种细胞应答[2，5，6]，在多种哺乳动物体内TRPM7作为镁离子通道行使其功能。

本课题应用siRNA技术下调大鼠心肌细胞的TRPM7后，发现胞内游离Ca2+浓度没有显著变化，推测TRPM7在心肌细胞的功能受到Ca2+的影响不显著。由于TRPM7优先对Mg2+和Ca2+通透，那么本课题的研究为以后深入开展心肌细胞中TRPM7的功能与Mg2+关系的研究奠定试验基础。

参考文献

1Nadler, Hermosura MC, Inabe K, et al.LTRPC7 is a Mg.ATP-regulated divalent cation channel required for cell viability[J].Nature, 2001, 411(6837): 590-595.

2Aarts M, Lihara K, Wei WL, et al.A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death[J].Cell, 2003, 115(7): 863-877.

3Wykes RC, Lee M, Duffy SM, et al.Functional transient receptorpotential melastatin7channels are critical for human mast cell survival[J].The Journal of Immunology, 2007, 179(6): 4045-4052.

4Schmitz C,Dorovkov MV,Zhao X, et al.The channel kinases TRPM6 and TRPM7are functionally nonredundant[J].J Biol Chem,2005,280(45):37763-37771.

5Schmitz C, Perraud AL, Johnson CO, et al.Regulation of vertebratecellular Ca2+homeostasis by trpm7[J].Cell, 2003, 114(2): 191-200.

6Wei C, Wang X, Chen M, et al.Calciumflickers steer cell migration[J].Nature, 2009, 457: 901-905.

作者单位：潍坊护理职业学院261041

The study is to investigate the impacts of downregulation of TRPM7 on calcium homeostasis in rat cardiomyocytes

(ZHAOHongxia,LIFaen.Weifangnursingvocationalcollege,Weifang261041，China.)

【Abstract】ObjectivesTRPM7 is a magnesium and calcium permeable channel expressed in cardiac myocytes.In order tostudy the function of TRPM7gene in myocardial cells deeply，this study tried to determined the impacts of downregulation of TRPM7 on calciumhomeostasis in rat cadiocyte.MethodsPrimary culture of rat myocardial cells, determination of the degree of myocardial cells survive, siRNA technique, detection of the fluorescence intensity of intracellular free Ca2+concentration in rat myocardial cells. ResultsThe fluorescence intensity of calcium in rat cadiocyte were no significant change after downregulation TRPM7. ConclusionsThere was no significant effect on calcium metabolism in rat cadiocyte in culture after downregulation TRPM7.

【Key words】TRPM7, siRNA, intracellular free Ca2+concentration, cadiocyte

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2016.02.014

收稿日期：2016-3-11