瘦素受体基因Gln223Arg变异对代谢综合征患者动态血压的影响*

陈海翎，王　倩，李菊芬，邓丽丽

(北京积水潭医院内分泌科　100035)



瘦素受体基因Gln223Arg变异对代谢综合征患者动态血压的影响*

陈海翎，王倩，李菊芬，邓丽丽

(北京积水潭医院内分泌科100035)

[摘要]目的探讨瘦素受体基因Gln223Arg变异与代谢综合征的相关性及其对动态血压的影响。方法选取来该院就诊的代谢综合征患者167例，健康体检者216例，均进行血压、动态血压、生化指标、胰岛素检查。以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)行DNA多态性分析，电泳并测序判断瘦素受体基因Gln223Arg基因型。结果检测到AA、GG、AG 3种基因型。代谢综合征组携带A等位基因的频率显著高于对照组，携带A等位基因发生代谢综合征和发生血压节律呈非杓型的风险分别是携带G等位基因的3.302倍(P=0.000；95%CI:2.432～4.483)和2.506倍(P=0.000；95%CI：1.566～4.008)。AA基因型患者具有较高的体质量指数、血糖、血压、空腹胰岛素水平，血脂紊乱更严重，腰围更大，胰岛素抵抗指数更高。携带A等位基因的代谢综合征患者各项动态血压指标较高。结论瘦素受体基因Gln223Arg多态性A等位基因携带者发生代谢综合征的风险大，动态血压指标较高，并且更倾向于非杓型的血压节律。

[关键词]瘦素受体；基因多态性；代谢综合征；动态血压

目前瘦素、瘦素受体(leptin receptor,LEPR)及其基因受到国际上广泛关注。由肥胖基因编码的蛋白质激素瘦素在与LEPR结合后可抑制食欲、减少热量摄取、提高机体代谢率及减少脂肪堆积。而研究发现LEPR基因与肥胖、高血糖、高血压、高血脂等密切相关。这些危险因素在同一个体的集聚构成了代谢综合征(metabolism syndrome,MS)，集聚的危险因素也造成了MS患者极高的心血管疾病发病率和病死率。而动态血压监测发现血压节律的紊乱使心血管系统长时间处于过重负荷状态,导致心、脑和肾脏等靶器官损害的风险增加[1]。目前，关于LEPR基因Gln223Arg多态性与MS的关系及其对于动态血压的影响的报道较少，基于此，本文探讨LEPR基因Gln223Arg变异与MS的相关性及其对于动态血压的影响。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1MS组167例(男92例，女75例)MS患者均为2005年10月至2012年6月本院门诊初诊未经治疗的MS患者，均符合2005年国际糖尿病联盟(IDF)的MS诊断标准[2]：男性腰围大于或等于90 cm，女性腰围大于或等于80 cm，符合以下因素中任意2项，(1)三酰甘油(TG)≥1.70 mmol/L;(2)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)减低，男性低于1.0 mmol/L,女性低于1.30 mmol/L;(3)血压升高,收缩压(SBP)≥130 mm Hg和(或) 舒张压(DBP)≥85 mm Hg;(4)空腹血糖(FPG)≥5.6 mmol/L。排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病患者。

1.1.2对照组本院同期健康体检者216例(男121例，女95例)，根据体检结果排除了肥胖、血压、血脂、血糖等异常，并排除有高血压、肥胖、高血脂、高血糖家族史者。

1.2方法采用盐析法抽提DNA，DNA多态性分析采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法。

1.2.1引物设计与合成上游：5′-ACC CTT TAA GCT GGG TGT CCC AAA TAG-3′；下游：5′-AGC TAG CAA ATA TTT TTG TAA GCA ATT-3′。特异性扩增包含Gln223Arg位点的序列。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并进行质量鉴定。

1.2.2PCR扩增PCR扩增标准程序(英国Hybaid Express 全自动PCR扩增仪)，(1)预变性：94 ℃ 5 min；(2)PCR反应：94 ℃ 5 s；(3)退火：59.4 ℃ 40 s；(4)延伸：72 ℃ 45 s。共循环36次，72 ℃再延伸10 min。

1.2.3限制性核酸内切酶酶切取PCR扩增产物8.2 μL，10×Buffer 1 μL，Msp I(英国Biolabs公司)8 μL，dH2O 20 μL，水浴(37 ℃)4 h。

1.2.4电泳判断基因型及测序酶切产物点样至含溴化乙啶的2%的琼脂糖凝胶，电压120 V电泳40 min；紫外灯下检测照相；于美国Kodak凝胶成像系统观察电泳图；由国家人类基因组北方研究中心进行抽样测序，核实基因型。

1.2.5身高、体质量、腰围、SBP、DBP等数据采集对照组及MS组患者测量身高、体质量、腰围并计算体质量指数(body mass index,BMI)。测量SBP、DBP并佩戴美国DMS动态血压监测仪进行动态血压监测(ambulatory blood pressure monitoring，ABPM)。以24 h动态血压均值130/80 mm Hg,白昼均值135/85 mm Hg，夜间均值120/75 mm Hg，夜间血压下降率超过10%为正常参照值。其中，夜间血压下降率=(白昼均值-夜间均值)/白昼均值；收缩压(舒张压)负荷为监测过程中收缩压(舒张压)超过140(90)mm Hg的次数百分率。

1.2.6胰岛素抵抗采用日立7170型全自动生化仪检测清晨空腹血脂等生化指标。采用放免法测定空腹血清胰岛素(Insulin)，胰岛素测定中使用的试剂均由北京北方生物制剂所提供，按照说明书操作。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)评估用稳态模型评估法计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment insulin resistance index,HOMA-IR)，即:HOMA-IR=空腹胰岛素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

2结果

2.1多态性基因型分析PCR扩增产物片段大小为 421 bp，酶切后3种基因型产生3种酶切产物。AA纯合子(Gln/Gln,Gln223):421 bp 、GG纯合子(Arg/Arg,Arg223):294+127 bp和AG杂合子(Gln/Arg,Gln223/Arg223):421+294+127 bp。电泳图见图1，测序结果见图2。

2.2Hardy-Weinberg平衡检验经Hardy-Weinberg平衡检验显示，基因型分布的Pearson chi-square P值在MS组为0.632，在对照组为0.778(P>0.05)，提示Gln223Arg基因型分布频率达到遗传平衡，具有群体代表性。

2.3基因多态性与发生MS的关系MS组年龄范围为25～78岁，对照组为26～77岁。两组一般临床情况及生化指标见表1，可见两组的年龄、性别构成比以及有吸烟史、饮酒史的比例差异无统计学意义，具有可比性。而MS组的BMI、血压以及不同性别患者的腰围均显著高于对照组(P<0.05)。MS组的空腹血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白、TG均显著高于对照组，而高密度脂蛋白显著低于对照组(P<0.05)。MS组的空腹胰岛素则显著高于对照组(P<0.01)。这均符合MS的疾病临床特点。

MI：Marker I，条带为100、200、300、400、500、600 bp；P：PCR产物，421 bp；AA(Gln/Gln):421 bp；GG(Arg/Arg):294+127 bp；AG(Gln/Arg):421+294+127 bp。

图1LEPR基因Gln223Arg 多态性代谢综合征MS pⅠ酶切电泳图

表1　MS组与对照组一般临床资料比较±s)

*:P<0.05;**:P<0.01。

表2　MS组与对照组LEPR 基因Gln223Arg基因型构成比与等位基因频率[n(%)]

**:P<0.01。

图2　LEPR基因Gln223Arg多态性测序结果(突变周围)

两组LEPR基因Gln223Arg多态性各基因型、等位基因频率的比较见表2。可见两组基因型构成比与等位基因频率均存在显著差异，MS组AA基因型及AG基因型所占比例显著高于对照组，MS组携带A等位基因的频率显著高于对照组(P<0.01)。在等位基因频率的比较中，OR值为3.302(95%CI,2.432～4.483)，即携带有A等位基因发生MS的风险是携带G等位基因的3.302倍。

2.4基因多态性各基因型对代谢综合征各组分的影响MS组患者按照LEPR基因Gln223Arg多态性的3种基因型分组后，3组间年龄差异无统计学意义。但AA基因型患者具有较高的BMI、血糖水平、血压水平、空腹胰岛素水平，血脂紊乱更严重，腰围更大，胰岛素抵抗指数更高，差异有统计学意义，其中血糖、TG、高密度脂蛋白及胰岛素抵抗指数的差异有统计学意义(表3)。

2.5各基因型对MS患者动态血压的影响MS组动态血压监测97.36%符合动态血压诊断高血压的标准。不同基因型间24 h、白天、夜间血压以及血压最大值、最小值、血压负荷、心率各项动态血压指标均有AA>AG>GG 的趋势。除了最小收缩期血压、最小舒张期血压和夜间舒张期血压外，其余各项指标在3种基因型间的差异均有统计学意义(P<0.05)。其中收缩期血压负荷在3种基因型间的差异有统计学意义(P=0.006)，见表4。

以夜间血压下降率是否大于或等于10%化分血压节律是否为杓型，结果MS组患者3种基因型发生血压非杓型的比例同样是AA>AG>GG(P=0.000)。携带A和G等位基因发生血压节律呈非杓型的比率例分别为76.57%和56.60%(P=0.000)。携带A等位基因发生血压节律呈非杓型的风险是G等位基因的2.506倍(OR=2.506,95%CI：1.566-4.008)。

表3　MS组不同LEPR 基因Gln223Arg基因型的相关指标比较

*:P<0.05;**:P<0.01。

表4　LEPR基因Gln223Arg基因型对MS患者动态血压指标的影响

续表4　LEPR 基因Gln223Arg基因型对MS患者动态血压指标的影响

*:P<0.05;**:P<0.01。

3讨论

肥胖基因的蛋白产物瘦素具有控制食物摄入、能量消耗、防止异位脂质沉积、改变肌肉或肝脏的胰岛素敏感性、联接免疫系统与内分泌系统等广泛的生物学效应，因而与肥胖及其代谢紊乱相关[3]。瘦素需与其特异性的LEPR相结合作用发挥。突变频率较高的Gln223Arg多态性是LEPR胞外区基因的编码区第6外显子上第668位碱基突变。这可造成谷氨酰胺变为精氨酸，导致LEPR与瘦素亲和力及信号传导过程的改变，影响瘦素与受体结合和作用的发挥。

LEPR基因Gln223Arg变异已被证实与肥胖[4]、2型糖尿病(T2DM)[5]、高血压[6]、血脂紊乱[7]等诸多心血管疾病危险因素密切相关。而且国外研究发现Gln223Arg多态性可能还是MS的易感因素[8]。MS正是上述多种心血管危险因子在同一个体聚集的集中表现，这种协同作用危害更大[9]。但目前关于LEPR基因Gln223Arg变异与MS相关性的研究国内罕见报道，对动态血压的影响亦欠明确。

在诊断上，本研究采用了2005年国际糖尿病联盟(IDF)标准，并按其要求选用了国人特异性的腰围切点，而未采用2004年的中华医学会糖尿病学分会(CDS)的标准。其主要原因是一些研究认为IDF标准作为目前全球最新标准诊断MS比较灵敏(灵敏度为100%,特异度为92.5%)，而对于非MS者,则与CDS标准有同样的鉴别力[10]。

本研究中，携带有A等位基因发生MS的风险是G等位基因的3.302倍。携带有A等位基因的MS患者发生胰岛素抵抗的风险是G等位基因的3.446倍,而且代谢紊乱更加严重。巴西学者的研究亦支持LEPR基因Gln223Arg多态性是MS的易感因素[8]，但其研究认为带来MS高发风险的是G等位基因。检索近年来中外学者对LEPR基因Gln223Arg多态性与肥胖、T2DM、高血压、血脂紊乱、等MS的单一组分之间的关系的研究发现，结论也并不一致。目前越来越多的研究肯定了A等位基因携带者具有更高的血糖[5]、血压[6]、胰岛素水平[11]，更严重的血脂紊乱[7]和更加肥胖[4]。这些均支持本研究的结论。因此有理由相信LEPR基因Gln223Arg多态性A等位基因是MS及其各组分的易感因素。

笔者认为各研究存在较大分歧的原因可能有：(1)相同基因突变在不同人群中频率不同，所起的作用可能不同；(2)人类肥胖、血压、血糖等复杂性状受多因素、多基因的影响,单个基因的影响相对较小。样本量有限时,对微效基因相关性的分析将受到影响。而且一个基因上的一点变异也不可能完全概括该基因对表型的全部作用。(3)各研究的方案设计及样本的选择方法也不相同。特别是当入选者为老龄人群时，不良生活习惯等环境因素对于疾病的影响将远远大于对年轻人群的影响，甚至最终完全逆转了基因对于疾病的影响。本研究入选者近400例，而且MS组选择的是初发患者，平均年龄在中年水平，尽可能减少了这些因素的影响。

考虑LEPR基因Gln223Arg多态性变异导致代谢紊乱的可能机制为:Gln223Arg多态性基因变异导致LEPR表达减少和蛋白结构异常,影响其信号转导功能[4]，造成受体不敏感，分泌过多的瘦素。瘦素与其他细胞因子等相互作用，通过交感神经系统的激活[12]、迷走神经调节功能受损[13]、一氧化氮机制[14]、肾素-血管紧张素系统[15]、IR[16]等机制共同促进了肥胖、高血压、高血糖、血脂紊乱等危险因素的丛集出现，进而出现MS。

另外本研究发现，携带A等位基因的MS患者各项动态血压指标较高，而且发生血压节律呈非杓型的风险是G等位基因的2.506倍。这说明带有A等位基因者高血压更加严重，并且容易发生血压节律的改变。具体血压节律紊乱的原因可能与前面提到的基因变异最终引起交感及副交感神经活动失常有关，最终导致血压节律呈非杓型。而节律的变异使心血管系统更长时间地处于过重负荷状态,导致心、脑和肾脏等靶器官损害的全面风险增加[1]。故血压的昼夜节律是判断高血压病情严重程度的重要指标之一。研究表明非杓型血压节律者有更高的心律失常检出率[17]以及卒中和心肌梗死发生率[18]，而且可导致内皮功能障碍及血小板聚集、黏附能力增加[19]。国外研究甚至认为非杓形血压是心肌重构及左室舒张功能障碍的决定因子[20]和卒中、心肌梗死风险的最佳预测因素[18]。而且非杓形血压是独立于血压负荷及其他引起肾损害的危险因素之外的肾功能恶化危险因素[21]。

虽然种族和表型研究结果的多样化提示LEPR基因Gln223Arg多态性可能为MS各单一组分的微效作用基因，但重要的是本研究提示了这一变异带来了明显的危险因素丛集。研究国人这一多态性与MS及血压节律间的关系,有助于找到MS发病的遗传机制,及早发现危险人群。同时本研究提示，对于存在Gln223Arg多态性变异的患者应早期开展对心脏病变的1级预防治疗,重视对于动态血压监测中血压节律的改善。而且防治措施应该是多角度多环节的，不仅侧重于各危险因素的逐一控制，更应积极干预其深层发生机制如IR、交感神经活性等。

由于复杂的基因-环境相互作用，本研究样本量仍显不足。本研究也未进行瘦素水平的检测。今后,为了排除多基因遗传和环境因素相互协同或干扰作用，尚需更全面的横向的基因联合变异研究，以进一步揭示真实的遗传基础。

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Influence of leptin receptor gene Gln223Arg variation on ambulatory blood pressure in patients with metabolism syndrome*

Chen Hailing,Wang Qian，Li Jufen，Deng Lili

(Department of Endocrinology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the correlation between leptin receptor(LEPR) gene Gln223Arg variation with metabolism syndrome and its influence on ambulatory blood pressure.MethodsTotally 167 patients with metabolism syndrome were selected and contemporaneous 216 individuals undergoing the physical examination were selected as the control group.The blood pressure,ambulatory blood pressure,biochemical indicators and insulin were detected in all the subjects.The DNA polymorphology analysis was performed by adopteint PCR-restricted fragment length polymorphism(RFLP).The Gln223Arg genotype was judged by electrophoresis and sequencing.ResultsThree genotypes of AA,GG and AG were detected.The frequency of carrying A alleles in the metabolism syndrome group was significantly higher than that in the control group.The occurrence risk of metabolism syndrome and non-dipper type blood pressure rhythm for carrying allele A was 3.302 times(P=0.000；95%CI:2.432-4.483)and 2.506 times of carrying allele G(P=0.000；95%CI：1.566-4.008).The patients with AA genotype had higher BMI，blood pressure,blood glucose and fasting insulin levels,more serious dyslipidemia,greater waist circumference and higher insulin resistance index.The patients with metabolism syndrome carrying A allele also had higher ambulatory blood pressure indexes.ConclusionLEPR gene Gln223Arg polymorphism A allele carrier has the great risk for metabolism syndrome occurrence,higher ambulatory blood pressure,moreover is more inclined to non-dipper type blood pressure rhythm.

[Key words]leptin receptor;gene;polymorphism,metabolism syndrome；ambulatory blood pressure monitoring

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.016

* 基金项目：北京市保健专项资金资助项目(京06-09号)。

作者简介：陈海翎(1972-)，博士，副主任医师，主要从事糖尿病，骨质疏松，代谢综合征方面的研究。

[中图分类号]R589

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)09-1201-05

(收稿日期：2015-09-29修回日期：2015-12-16)