CDH13表达下调对膀胱癌细胞迁移和侵袭及PI3K/Akt表达的影响

林英立　李艳丽　戚景光　马建国　李文平　孙光

221005 徐州市肿瘤医院泌尿外科(林英立、戚景光)；徐州市肿瘤医院科教科(李艳丽)；河北医科大学第三医院泌尿外科(马建国、李文平)；天津医科大学第二医院泌尿外科(孙光)



·实验研究·

CDH13表达下调对膀胱癌细胞迁移和侵袭及PI3K/Akt表达的影响

林英立李艳丽戚景光马建国李文平孙光

221005 徐州市肿瘤医院泌尿外科(林英立、戚景光)；徐州市肿瘤医院科教科(李艳丽)；河北医科大学第三医院泌尿外科(马建国、李文平)；天津医科大学第二医院泌尿外科(孙光)

【摘要】目的研究膀胱癌5637细胞中CDH13表达下调后对细胞迁移、侵袭和PI3K/Akt表达的影响以及它们间的关系。方法应用RNA干扰技术抑制人膀胱癌5637细胞株中CDH13的表达，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell 小室法检测细胞侵袭能力，Western blot检测CDH13、PI3K及Akt的表达水平。结果膀胱癌5637细胞中CDH13表达下调后细胞迁移和侵袭能力增强，PI3K及Akt的表达增加。结论膀胱癌细胞中CDH13表达下调可能通过激活PI3K/Akt通路促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。

【关键词】膀胱癌；迁移；侵袭；CDH13

膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来随着暴露于危险因素的增加及人口的老龄化，其发病率呈上升趋势[1-3]。CDH13是近年来新发现的一个抑癌基因，其表达下调与多种肿瘤的发生、发展密切相关[4]。我们前期的研究发现CDH13在膀胱癌组织中表达减少，并与肿瘤的分期、分级密切相关[5-8]。在本研究中我们应用RNA干扰技术抑制CDH13在膀胱癌5637细胞中的表达，检测CDH13表达下调对肿瘤细胞迁移、侵袭及PI3K/Akt表达的影响，并探讨它们之间的关系。

材料与方法

一、材料

人膀胱癌5637细胞株购自中国科学院细胞库， RPMI 1640培养液购于美国Gibeo公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程公司，兔抗人CDH13多克隆抗体、兔抗人PI3K多克隆抗体、兔抗人Akt多克隆抗体、CDH13 shRNA Plasmid、Control shRNA Plasmid购于美国Santa Cruz公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司，MTT购自美国Sigma公司，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。

二、细胞培养及转染

5637细胞常规培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5% CO2孵育箱中培养。本研究分为3组，A：正常对照组(1×PBS)；B：阴性对照组(Control shRNA Plasmid)；C：实验组(CDH13 shRNA Plasmid)。取对数生长期的5637细胞用胰酶消化并计数，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为2×105/ml，取500 μl接种于6孔板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合度达80% 时进行转染，操作按照LipofectamineTM2000 说明书进行，转染后细胞板置于37℃、5% CO2培养箱中培养。转染细胞传代培养，应用嘌呤霉素筛选稳定表达 shRNA 的细胞，Western blot检测CDH13基因的蛋白沉默效果[7-8]。

三、Western blot检测蛋白表达

收集各组细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上；5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4℃过夜，TBS洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，用ECL发光剂检测；各组以β-actin作内参，将每个样本的灰度值与内参灰度值比较，得出的比值代表蛋白的含量。

四、细胞迁移能力检测

应用划痕实验检测细胞迁移能力，在玻璃培养皿中心加入150 μl浓度为10 μg/ml的纤维蛋白，将细胞种植于培养皿中心部过夜，用200 μl枪头尖端在培养皿细胞层划痕，分别于不同时间段在显微镜下观察、拍照,测量划痕宽度的变化。

五、Transwell小室法检测细胞侵袭能力

待测细胞培养至对数期，消化细胞，用PBS和无血清培养液先后洗涤1次，用无血清培养液悬浮细胞，计数，调整浓度为1×105/ml，在下室(即24孔板底部)加入600 μl含10%胎牛血清RPMI 1640培养液，在上室加入150 μl细胞悬液，在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后进行观察，计数基底膜下室的细胞数，显微镜下(400×)随机选择6个视野计数，取平均值为穿过基底膜的细胞数，细胞数代表其侵袭能力。

六、统计学方法

结果

一、RNA干扰抑制膀胱癌5637细胞CDH13蛋白的表达

shRNA转染后实验组CDH13蛋白表达水平明显低于正常对照组和阴性对照组(图1)；正常对照组、阴性对照组和实验组的CDH13蛋白与内参蛋白相对灰度值比分别为(1.182±0.046)、(1.158±0.055)、(0.187±0.015),实验组与正常对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),正常对照组和阴性对照组间CDH13表达差异无统计学意义(P>0.05)。

二、CDH13表达下调对膀胱癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示CDH13表达下调后细胞迁移能力明显增强，与正常对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表1、图2)。

与正常对照组和阴性对照组比较*P<0.05

三、CDH13表达下调对膀胱癌细胞侵袭能力的影响

Transwell小室实验结果显示CDH13表达下调后细胞侵袭能力明显增强，与正常对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05，图3)。正常对照组、阴性对照组和实验组穿过虑膜的细胞数分别为(58.667±3.886)、(60.735±2.871)、(125.333±7.361)。

四、CDH13表达下调对膀胱癌细胞PI3K/Akt表达的影响

实验组PI3K和Akt蛋白表达水平明显高于正常对照组和阴性对照组(图4)，实验组与正常对照组和阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，正常对照组和阴性对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组、阴性对照组和实验组的PI3K蛋白与内参蛋白相对灰度值比分别为(0.654±0.037)、(0.589±0.082)、(1.013±0.027)；正常对照组、阴性对照组和实验组的Akt蛋白与内参蛋白相对灰度值比分别为(0.469±0.033)、(0.437±0.051)、(0.768±0.061)。

讨论

膀胱癌的发生、发展是一个多因素参与的复杂过程，在危险因素的作用下癌基因的激活和抑癌基因的失活促进均参与其中[9-10]。CDH13是近年来新发现的一个抑癌基因，CDH13基因定位于人染色体16q24，在许多肿瘤中人染色体16q24经常发生突变、缺失以及启动子甲基化等，进而影响基因所编码蛋白的表达。研究发现CDH13在多种肿瘤中表达减少或缺失，且CDH13表达下调与肿瘤的发生、增殖和侵袭等有着非常密切的关系[4]。我们前期的研究发现在膀胱癌组织中CDH13因其基因启动子甲基化而表达减少，并且与膀胱癌的恶性生物学行为及不良预后有关[11-13]。CDH13是钙粘蛋白家族的一员，其参与调节机体内许多生物加工过程，包括钙介导的细胞黏附、细胞极性和形态形成，细胞的聚集和迁移，细胞的识别和信号传导机制以及肿瘤的发生、发展等过程[4]。然而，CDH13表达是通过何种机制促进肿瘤发生、发展的目前尚不清楚。

研究表明PI3K/Akt信号通路在大多数人类肿瘤中调节着肿瘤细胞的增殖和凋亡，并且与肿瘤的血管形成和侵袭、转移以及对化疗耐药、放疗抗拒密切相关，目前在肿瘤研究中备受关注[14]。激活的Akt重新定位到胞质、核内或细胞内的其他部位，磷酸化相关的一些底物蛋白，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移过程中发挥着重要的作用[14]。研究发现在胆囊癌细胞中CDH13表达减少且伴随着PI3K和Akt表达的增高，并且应用转基因技术使CDH13在胆囊癌细胞中表达增高后可抑制PI3K和Akt的表达，CDH13可能通过PI3K/Akt通路调节肿瘤细胞的生物学行为[15]。然而在膀胱癌中CDH13表达减少是否对PI3K和Akt的表达产生影响、是否通过PI3K/Akt途径促进膀胱癌发展，目前尚无研究报道。因此在本研究中我们应用RNA干扰技术抑制CDH13在膀胱癌中的表达，并研究CDH13表达下调对细胞迁移、侵袭以及PI3K、Akt表达的影响，探讨CDH13表达下调是否通过PI3K/Akt途径促进膀胱癌发展，为膀胱癌的治疗提供新的思路和理论依据。

我们的研究结果发现应用RNA干扰技术使CDH13在膀胱癌5637细胞中表达减少后，细胞的迁移和侵袭能力明显增强。我们的结果与以往在肝癌、乳腺癌及前列腺癌等肿瘤中的研究结果一致[4,16-18],并且，在膀胱癌细胞中CDH13表达减少后PI3K及Akt的表达明显增加。研究表明CDH13低表达将导致多中心体细胞的出现，而Akt是参与调节中心体的主要蛋白激酶[14]。这些结果表明CDH13表达下调可能通过PI3K/Akt通路促进膀胱癌的发展。

综上所述，在膀胱癌细胞中CDH13表达下调后细胞迁移和侵袭能力增强，并且PI3K及Akt表达明显增加，这表明CDH13表达下调可能与PI3K/Akt通路有关。

参考文献

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(本文编辑：熊钰芬)

The influence of down-regulation expression of CDH13 on the migration, invasion and PI3K/Akt expression of bladder cancer cell

LINGYing-li*,LIYan-li,QIJing-guang,MAJian-guo,LIWen-ping,SUNGuang.

*DepartmentofUrology,XuzhouCancerHospital,Xuzhou221005,ChinaCorrespondingauthor:LINGYing-li,E-mail:lylxz2012@126.com

【Abstract】ObjectiveThe aim of this study was to investigate the influence of down-regulation expression of CDH13 on the migration and invasion of bladder cancer cell and PI3K/Akt expression, as well as the relationship between them. MethodsRNA interference was used to inhibit CDH13 expression in 5637 cells, wound healing was used to examine cell migration, Transwell was used to evaluate cell invasion, the expression of CDH13, PI3K and Akt was examined by Western blot. ResultsThe bladder cancer cell migration, invasion and PI3K/Akt expression was increased after the down-regulation of CDH13. ConclusionsDown-regulation expression of CDH13 in bladder cancer cell maybe promotes tumor cell migration and invasion through PI3K/Akt pathway.

【Key words】Bladder cancer;Migration;Invasion;CDH13

基金项目：徐州市医学青年后备人才项目(2014007)；徐州市科技计划项目(KC14SH015)；江苏大学临床科技发展基金项目(JLY20140109)；江苏省“六大人才高峰”资助项目(2014-WSW-066)；江苏省卫计委青年科研课题项目(Q201514)

通信作者：林英立，E-mail:lylxz2012@126.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.01.009

(收稿日期：2015-12-23)