5-羟色胺1A受体基因C（-1019）G（rs6295）单核苷酸多态性与中国汉族人群焦虑障碍的关联分析*

谢　正，王　娜，李恒芬，赵晓峰，邱鸿钟

（1.广东中医药大学经管学院，广东广州510006；2.河南省郑州市第九人民医院精神科，河南郑州450053；3.郑州大学第一附属医院精神科，河南郑州450052；4.郑州大学第一附属医院药学部，河南郑州450052）



5-羟色胺1A受体基因C（-1019）G（rs6295）单核苷酸多态性与中国汉族人群焦虑障碍的关联分析*

谢正1，王娜2，李恒芬3，赵晓峰4，邱鸿钟1

（1.广东中医药大学经管学院，广东广州510006；2.河南省郑州市第九人民医院精神科，河南郑州450053；3.郑州大学第一附属医院精神科，河南郑州450052；4.郑州大学第一附属医院药学部，河南郑州450052）

摘要：目的探究5-羟色胺1A受体（5-HT1AR）基因C（-1019）G（rs6295）单核苷酸多态性（SNP）是否与中国汉族人群焦虑障碍［广泛焦虑障碍（GAD）和惊恐障碍（PD）］相关。方法采用连接酶反应技术（LDR）检测5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）SNP在319例焦虑障碍患者（210例GAD患者和109例PD患者）及300例健康者（对照组）中的分布，根据精神障碍诊断与统计手册（DSM-IV）诊断系统诊断GAD和PD。另外，比较5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）SNP在GAD+PD组、对照组之间的性别差异。结果GAD+PD组与对照组5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）SNP的基因型和等位基因频度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论由于缺少相关联的证据，5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）可能不是汉族人群焦虑障碍有标志性意义的位点。

关键词：5-羟色胺1A受体；基因C（-1019）G；焦虑障碍；广泛焦虑障碍；惊恐障碍

在5-羟色胺的众多受体亚型中，5-羟色胺1A受体（5-HT1A receptor，5-HT1AR）被认为在调节情绪和焦虑有关的行为中起重要作用［1］。动物试验研究表明，敲除5-HT1AR的3个遗传背景不同的小鼠与野生型组比较，实验组表现出明显的焦虑症状［2］。在动物发育的早期阻断小鼠的5-HT1AR，能使成年后的小鼠出现焦虑症状［3］。正电子发射断层显像研究结果表明，惊恐障碍（panic disorder，PD）患者5-HT1AR结合力较对照组下降［4］，提示5-HT1AR基因可能与焦虑障碍相关。

在5-HT1AR众多单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点中，位于转录调节区C（-1019）G（rs6295）的多态性，尤为引起关注［5］。目前，国外已有5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）单核苷酸多态性与焦虑障碍相关的报道［6-7］，国内也有学者对五羟色胺转运体基因多态性与广泛焦虑障碍（general anxiety disorder，GAD）的相关性进行报道［8-9］，但未见5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）单核苷酸多态性与焦虑障碍的相关报道。因此，本研究探讨5-HT1AR基因单核苷酸多态性位点C（-1019）G（rs6295）是否和汉族人群焦虑障碍（GAD和PD）相关。

1　资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年2月-2014年12月在河南中医学院第一附属医院临床心理科和郑州市第九人民医院精神科门诊就诊或住院的患者。GAD患者210例，其中男性85例，女性125例；年龄18～60岁，平均（36.4±12.1）岁。惊恐障碍患者109例，男性45例，女性64例；年龄18～60岁，平均（33.2±10.6）岁。纳入标准：①符合精神障碍诊断与统计手册（diagnostic and statistical manual of mental disorders-Ⅳ，DSM-Ⅳ）中广泛性焦虑障碍或惊恐障碍的诊断标准；②排除继发及共病情况；③汉族。排除标准：①患有严重躯体疾病者；②精神活性物质滥用者；③有自杀企图者；④妊娠或哺乳期妇女。广泛性焦虑障碍诊断标准：①对于许多事件或者活动（比如工作、学习成绩等），呈现过分的焦虑和担忧（担忧的期望），至少持续≥6个月；②患者感觉难以控制自己不去担忧；③焦虑和担忧有以下6种症状中≥3项（在6个月中，多数日子里有至少几种症状），a.坐立不安或者感觉紧张；b.容易疲劳；c.思想难以集中，或者头脑一下子变得空白；d.易激惹；e.肌肉紧张；f.睡眠障碍（入睡困难或经常醒转，或辗转不安、令人不满的睡眠）。惊恐障碍诊断标准：①反复有不期而来的惊恐发作，一段时间有强烈的害怕或不适，≥4项下述的症状突然出现，且在10 min内达到高潮，a.心悸、或心率加快；b出汗；c震颤或发抖；d气促感或窒息感；e喉头哽塞感；f胸部疼痛或不适；g恶心或腹部不适；h头昏失平衡感、头重脚轻、晕厥；i现实解体（非真实感）或人格解体（感到脱离自己）；j害怕失去控制或发疯；k害怕即将死亡；l感觉异常（麻木或针刺感）；m发冷或潮热。②≥1次发作后10个月内存在以下≥1项：a.继续担心再度发作；b.忧虑发作所产生的影响或后果（例如失去控制、心脏病发作、将会发疯）；c.与发作有关的行为显著改变。

对照组来源于郑州市第九人民医院职工、进修医生、实习医生及体检中心体检者。纳入标准：①没有符合DSM-Ⅳ诊断标准的精神疾患；②汉族；③中学及以上文化程度；④愿意参加本研究。排除标准：①患严重躯体疾病者；②妊娠、哺乳及药物滥用者。对照组300例，其中男性141例，女性159例；年龄18～60岁，平均（35.4±10.7）岁。所有入组对象签署知情同意书。广泛性焦虑症、惊恐障碍患者与对照组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 实验方法

1.2.1 临床资料采集所有入组对象经2位副主任及以上医师明确诊断，并由经培训过的专职研究员完成基本人口学资料和包括首次发病年龄在内的临床资料采集，采用汉密尔顿焦虑量表（hamilton anxiety scale，HAMA）评定疾病严重程度。

1.2.2 DNA提取所有研究对象在完成临床资料采集后，于清晨空腹抽取肘前静脉血10 ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，总DNA抽取试剂盒为北京天根生化科技有限公司的AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒，按照试剂盒说明书进行DNA抽取，提取的DNA置于-70℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.3 SNP位点多态性检测5-HT1AR基因C （-1019）G（rs6295）位点多态性检测由上海翼和生物技术有限公司完成，采用高温连接酶检测反应基因芯片（ligation detection reaction techniques，LDR）技术测定基因多态性。rs6295正向引物：5'-ACGGAGG TACCGTTTTGTTG-3'，反向引物：5'-CCCAGAGTGG CAATAGGAGA-3'。LDR探针系列分别为rs6295_ modify：5'-PTTTTTAAAAAGCTACCTCCGTTCTCTTT TTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3'；rs6295_C：TTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTGGAAGAAGACCGAGTGTGTCTT CG；rs6295_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAAG AAGACCGAGTGTGTCTTCC。LDR反应原理为高温连接酶一旦检测到DNA与互补的寡聚核苷酸接头对应处存在基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。用Genemapper进行数据分析，位点的分型截图见附图。

附图　rs6295位点的分型截图

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，用χ2检验，分别比较GAD组、PD组及对照组的基因型、等位基因分布差异，并与广泛性焦虑症，惊恐障碍进行关联分析。用Hardy-Weinderg Diagnostics Version 2.0软件分析基因型、等位基因频率是否符合Hardy-Weinderg平衡定律，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 SNPs位点的检测结果及Hardy-Weinberg遗传平衡检验

采用Hardy-Weinberg遗传平衡（H-W平衡）检验，对rs6295的SNPs基因型和等位基因进行检验，发现其符合H-W平衡定律，其等位基因频率也符合H-W平衡定律。

2.2 各组SNPs位点基因型和等位基因分布的频度比较

研究发现，GAD+PD组rs6295位点的基因型频度为CC9.1％（29/319），CG39.8％（127/319），GG 51.1％ （163/319），其等位基因频度为C 29.0％（185/638），G 71.0％（453/638）；对照组rs6295位点的基因型频度为CC 7.3％（22/300），CG 32.0％（96/300），GG 60.7％ （182/300）；其等位基因频度为C 23.3％ （140/600），G 76.7％（460/600），经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=5.912和5.238，P=0.206和0.073）。本研究还探究rs6295位点的基因型和等位基因是否与性别差异有关。研究发现，男性GAD+PD组rs6295位点的基因型频度为CC 10.0％ （13/130），CG 38.4％（50/130），GG 51.5％（67/130），其等位基因频度为C 29.2％（76/260），G 70.8％ （184/260）；男性对照组rs6295位点的基因型频度为CC 7.1％（10/141），CG 29.8％（42/141），GG 63.1％ （89/141），其等位基因频度为C 22.0％（62/282），G 78.0％（220/282），经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=4.213和4.218，P=0.378和0.121）。女性GAD+PD组rs6295位点的基因型频度为CC 8.5％ （16/189），CG 40.7％（77/189），GG 50.8％（96/189），其等位基因频度为C 28.8％（109/378），G 71.2％（269/378）；女性对照组rs6295位点的基因型频度为CC 7.5％（12/159），CG 34.0％（54/159），GG 58.5％（93/159），其等位基因频度为C 24.5％（78/318），G 75.5％（240/318），经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=3.259和2.637，P=0.516和0.268）。见表1～3。

表1　3组rs6295基因型和等位基因分布的频度比较　例（％）

表2　男性患者与男性对照组基因型和等位基因分布的频度比较　例（％）

表3　女性患者与女性对照组基因型和等位基因分布的频度比较　例（％）

3　讨论

5-HT1AR基因位于5q11.2～13.1，是哺乳类动物脑中表达最多的亚型之一［10-11］。5-HT1AR作为突触前自主受体和突触后受体同时起作用，自主受体被5-HT或5-HT1A激动剂激活后可以减少5-HT能神经元的放电频率，继而减少神经末梢投射区域5-HT的合成、转运及释放。同时其还通过负反馈系统，调节突触间的神经传递。突触后5-HT1AR的激活将引起细胞膜的超极化，从而降低神经元的兴奋性，因此5-HT1AR是5-HT系统神经传递的重要调节因素［12］。

位于5-HT1AR基因上游调控区内的C（-1019）G基因多态性引起人们的兴趣，其所在区域内有一个26 bp不完全的回文结构，而C（-1019）G多态性位点与5-HT1AR基因的双重抑制因子作用类似，核畸形表皮自调节因子-1（deformed epidermal autoregulatory factor 1，DEAF-1）相关蛋白（nuclear DEAF-1-related protein，NUDR-protein）与发状分裂相关增强子（hairy and enhancer of split 5，Hes5）相邻。而C（-1019）G多态性位点能影响NUDR及Hes5的表达，使5-HT1A突触前、突触后受体表达受影响，导致5-HT系统神经传递发生异常改变，增加羁患精神障碍的风险［13］。FAKRA等［14］的研究进一步表明，C（-1019）G的C/G和G/G基因型与C/C型比较，能显著降低与威胁有关的杏仁核反应，而杏仁核被认为是情绪反应的中枢。因此本研究选取5-HT1AR基因C（-1019）G（rs6295）单核苷酸多态型与焦虑障碍（GAD和PD）进行关联分析。

本研究首次报道，5-HT1A的C（-1019）G基因多态性与中国汉族人群焦虑障碍（GAD和PD）的关联研究。本研究未发现，rs6295的3个基因型与焦虑障碍（GAD和PD）有关联。考虑到女性比男性更容罹患焦虑障碍［15］，本研究进行亚组分析，以期寻找影响焦虑障碍性别差异的生物学基础，但也未发现C （-1019）G多态型在性别中有差异。与CHOI［15］、CHIPMAN［16］、HETTEMA等［17］的研究结果一致。

考虑出现本研究结果可能是因为：①5-HT1AR 的C（-1019）G的多态性位点位于5-HT1A 5’端启动子区域，尽管其多态性导致转录活性的改变，影响所翻译的蛋白质产物表达，但是该产物可能对引起焦虑障碍（GAD和PD）的脑功能环路作用不大，推测该位点可能不是焦虑障碍（GAD和PD）的功能位点。②本研究仅考虑基因、性别因素在焦虑障碍（GAD和PD）病因中的作用，未将人格、生活事件和心理社会等因素纳入本研究行进一步分析，而既往的双生子研究证实，广泛性焦虑的遗传度约为37％［18］，因此在今后的研究中，应将基因—环境因素的交互作用加以考虑，以完整的阐述焦虑障碍（GAD和PD）的病因学机制。③本研究样本量较小可能会影响检验效能，导致假阴性结果的发生。

本研究结果表明，C（-1019）G的多态性与焦虑障碍（GAD和PD）可能无关联。但本研究样本量较小，今后仍需要大样本的重复研究，并在不同的种族中去探讨C（-1019）G的多态性与焦虑障碍的关联。同时将环境因素及社会心理学因素纳入研究行进一步分析，以探讨C（-1019）G基因多态性在焦虑障碍（GAD和PD）病因中的作用。

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（童颖丹编辑）

Association between polymorphisms of 5-HT1A receptor gene C（-1019）G（rs6295）and anxiety disorder in Chinese Han population*

Zheng Xie1，Na Wang2，Heng-fen Li3，Xiao-feng Zhao4，Hong-zhong Qiu1
（1. Economy and Management School，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China；2. Department of Psychiatry，the Ninth People's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou，Henan 450053，China；3. Department of Psychiatry，4. Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450052，China）

Abstract:Objective To explore the possible association between single nucleotide polymorphisms（SNPs）of 5-hydroxytryptamine 1A receptor（5-HT1AR）gene C（-1019）G（rs6295）and anxiety disorder［general anxiety disorder（GAD）and panic disorder（PD）］in Chinese Han population. Methods SNP of 5-HT1AR gene C（-1019）G（rs6295）were analyzed by a ligase detection reaction（LDR）-based method in 319 anxiety disorder cases（210 GAD cases and 109 PD cases）and 300 unrelated，sex-matched healthy control subjects. GAD and PD were diagnosed by Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders（DSM-IV）criteria. In addition，polymorphisms of 5-HT1AR gene were compared between male and female cases of anxiety and controls. Results No significant difference was observed between the anxiety patients and the healthy controls in thegenotype distribution and allele frequencies of the 5-HT1AR gene C（-1019）G. Similarly，no significant differences were found between male and female cases in the GAD cases and PD cases. Conclusions 5-HT1AR C（-1019）G may not be iconic locus in the Chinese Han population with anxiety disorders because of lack of evidence.

Keywords:5-HT1AR；C（-1019）G；anxiety disorder；general anxiety disorder；panic disorder

中图分类号：R749.4

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.006

文章编号：1005-8982（2016）11-0029-05

收稿日期：2015-11-04

*基金项目：国家自然基金（No：81371494）；河南省科技厅科技攻关项目（No：102102310379）

［通信作者］邱鸿钟，E-mail：xiezyp@126.com