循环肿瘤细胞的生物学特性及其意义

张凯莉　高小妹(综述)　钦伦秀1,2,△(审校)

(1复旦大学附属华山医院普外科　上海　200040; 2复旦大学肿瘤转移研究所　上海　200040; 3复旦大学生物医学研究院　上海　200032)



循环肿瘤细胞的生物学特性及其意义

张凯莉3高小妹3(综述)钦伦秀1,2,3△(审校)

(1复旦大学附属华山医院普外科上海200040;2复旦大学肿瘤转移研究所上海200040;3复旦大学生物医学研究院上海200032)

【摘要】循环肿瘤细胞 (circulating tumor cells,CTCs)是导致肿瘤发生远处转移的重要因素。近10年随着CTCs检测技术的进步,发现CTCs的数目与患者预后密切相关;根据CTCs的生物学特性进行亚群分型能够更合理地指导个体化治疗方案的选择。

【关键词】循环肿瘤细胞;肿瘤转移;肿瘤治疗

肿瘤细胞的播散是肿瘤发展进程中的重要特征[1],肿瘤细胞从原发病灶脱落,浸润基底膜,穿过血管壁进入血液循环形成循环肿瘤细胞 (circulating tumor cells,CTCs),随着血液循环到达并定植在远端器官或重新定植到原发病灶,导致原位复发和远端器官转移病灶的形成[2-3]。早在1869年Thomas Ashworth首次发现肿瘤患者外周血中存在CTCs[4]。CTCs作为转移病灶的种子前体,在肿瘤转移过程中扮演了十分重要的作用。近10年,由于其分离和鉴定技术的发展,CTCs再次成为肿瘤转移研究领域的热点。2015年至今关于CTCs的研究平均以每周25篇的速度呈现在PubMed,同时ClinicalTrials.gov上显示近720项以CTCs作为肿瘤生物学标记物的临床试验。越来越多的研究结果表明CTCs数目和其生物学特性与肿瘤转移紧密相关,且具有极为重要的临床指导意义。本文就CTCs的富集分离检测技术、生物学特征及潜在的临床应用这三方面对CTCs的研究现状作一综述。

CTCs的富集分离及鉴定的方法

CTCs的富集分离的方法主要基于CTCs不同于血细胞的生物学和物理学的特征。

基于生物学的分离方法在免疫磁珠富集分离方法问世之前,最常用的CTCs检测方法是基于CTCs表面标记物的流式细胞分选技术 (FACS),然而流式细胞分选技术灵敏度低、假阳性高,成为CTCs后续分析的一大障碍。之后免疫磁珠富集分离法是根据CTCs和血细胞差异表达的蛋白标志物进行阳性富集和阴性富集。首先根据CTCs和血细胞在胚胎发育过程中来源于不同的胚层。CTCs来源内胚层具有上皮样特性,高表达表皮标志物,如胞质上皮细胞角蛋白家族 (cytokeratins,CKs)和上皮细胞黏附分子 (epithelial cell adhesion molecule,EpCAM),其中EpCAM在CTCs中特异性高表达而在血细胞中不表达,能够有效地将完整的CTCs从血细胞中分离出来。基于这一原理将抗EpCAM抗体偶联到磁珠上,在磁场力的作用下将EpCAM高表达的CTCs从血细胞中分离出来。2004年研发的CellSearch system (Veridex)运用这一原理富集晚期乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者外周血中的CTCs,然后用CK8、CK18、CK19的混合抗体进行荧光染色鉴定,同时对仅在白细胞中高表达的CD45荧光染色,排除白细胞对CTCs判定的干扰。但CellSearch system (Veridex)检测到CTCs的数量极少,最近基于阳性选择而研发的MagSweeper[5],IsoFlux[6],VerIFAST[7]这3项技术极大地提高了CTCs的检测速度和效率。

美国麻省总院Toner教授等联合CTCs的生物学特性和物理学特性建立一个微流控装置平台CTC-chip,如抗原依赖性的免疫磁珠分离的Herringbone-chip[8]。然而,大量的研究证明肿瘤在发生侵袭转移的过程中会发生上皮间质转化 (epithelial mesenchymal-transition,EMT),即上皮样标志物如EpCAM、E-cadherin的下调,N-cadherin的上调。基于EpCAM的富集方法在检测CTCs可能存在细胞群体的限制,所以还有学者用器官特异性的细胞表面标志物或干细胞标志物来富集CTCs,如在乳腺癌中,除了通用的EpCAM,常用的标记物还有CK19、HER2、ER、PR和MUC1等,前列腺癌的标志物有AR、EGR和PTEN。肝细胞癌的常用标记物有Cytokeratins、EpCAM、ASGPR1、N-cadherin、Vimentin、Gpc3、AFP和albumin等[9]。此外,Toner组根据流体确定的侧向位移,惯性聚焦和磁导入研发的CTC-iChip[10],可直接从全血中分离出具有活性的CTCs,回收效率较CellSearch system (Veridex)由1/107显著提高到1/105。最近,这个研究团队又研发出用于分离CTCs团簇的的微流控装置[11]。对于CTCs的富集分离不仅吸引生物学家和物理学家的兴趣,同时材料科学家也积极参与CTCs富集分离的研究中。值得一提的是Tseng HR课题组研发的系列NanoVelcro chips,可通过改变反应温度收集芯片中捕获的CTCs[12]。

基于物理学的富集分离的方法依据CTCs不同于血细胞的物理特性如细胞大小[13]、密度、形变性[14]及载电量进行富集分离。

Vona等[15]根据HepG2、Hep3B、MCF7、HeLa和LNCaP的大小参数设计了ISET (isolation by size of epithelial tumor cells),可对1 mL全血中的CTCs进行计数,免疫形态学鉴定和分子表征的分析。根据肿瘤细胞与白细胞的密度差异,可进行密度梯度离心法进行分离,主要用试剂盒OncoQuick plus和Ficoll。这两种方法要求的血量比较大,一般需要15～30 mL,CTC团簇在该方法中可能沉降入红细胞层而丢失。物理学方法分离获得的CTCs通常会存在较大的白细胞污染,直接影响对CTCs的分子生物学特性的分析。

富集分离之后的CTCs的鉴定方法主要根据肿瘤细胞基因组的异倍性、转录组的特异性及标志性的蛋白质表达进行最终确定。经典的方法集中在染色体的比较基因组杂交 (comparative genomic hybrid,CGH)/DNA或RNA荧光原位杂交 (fluorescenceinsituhybridization,FISH)、实时定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR),以及CTCs在蛋白质水平通过免疫荧光进行亚群的分子分型。目前比较成熟的体外CTC富集检测系统有CellSearch®system、MagSweeperTM、EPHESIA CTC-chip、CTC-chip、Velcro-like device;体内CTC富集系统有CellCollector®、Photoacoustic和Nanodetector。

CTCs的临床应用及其潜在应用价值2004年,经美国FDA认证的CellSearch system (Veridex)系统对转移性乳腺癌[16]、前列腺癌[17]和结直肠癌[18]患者7.5 mL血样中进行CTCs检测计数,并与患者预后作相关分析,发现系统治疗之前的CTCs可作为预测患者预后的独立指标。此后,在小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肝癌和肝胆管癌中[19-22],以CellSearch system (Veridex)系统为平台检测治疗前CTCs数目并分析与患者的预后相关性,进一步证明CTCs可作为肿瘤预测患者预后的独立指标。同时,对外周血单核细胞通过RT-PCR分析CTCs特异性的EpCAM[23]、Snail[24]的mRNA表达水平发现,EpCAM或Snail的mRNA丰度也可以作为预测肝癌患者预后的独立指标。同时作为患者预后的生物学标志的血清蛋白标志物和CTCs之间是否具有相关性呢？在前列腺癌中发现,基线CTCs数目与肿瘤大小,常规的血清蛋白质标志物如PSA没有明显的相关性[25-26]。在患者体内,CTCs不断从原发病灶或者是转移病灶进入血液循环[27],所以CTCs的数目存在时空的异质性。目前,CTCs的数目被认为在治疗期间的变化有可能作为评判治疗效果的指标。Bidard等[28]开展关于CTCs在转移性乳腺癌患者临床应用中的有效性的多中心研究再次证实治疗前CTCs大于5的患者比小于5的患者具有更短的无进展生存期和总体生存期,开展治疗后,对患者CTCs实时监测,相较于治疗前的CTCs数目,在3～5周时CTCs数目增加的患者比6～8周CTCs数目增加的患者的预后要差,而同一时间点癌胚抗原和肿瘤抗原浓度变化与患者临床预后的相关性不如CTCs数目的变化理想。综上,CTCs数目的多少及其在治疗中数目的k变化可用于判断患者的预后生存情况和治疗方案的有效性,但CTCs数目并不能精准地指导治疗方案的选择,故在CTCs计数的临床意义研究之后,科学家将研究方向转向CTCs的生物学特性研究。

CTCs的生物学特性研究在CTC富集分离的技术日渐成熟后,随着单细胞研究技术的不断革新,关于CTC 的研究逐步由探寻某种实体瘤中CTC数目与患者预后的关系以及药物疗效的监测方面转向CTC的生物学特征与肿瘤转移。肿瘤细胞离开原发瘤,进入血液循环,成为单个细胞,失去细胞间相互作用而发生失巢凋亡。最近在转移性乳腺癌中发现抗凋亡蛋白BCL-2在CTCs中高表达,但结果与预期相反,具有高表达BCL-2的CTCs的患者预后好[29],这一现象需要进一步的研究结果来解释。

现有的研究表明肿瘤具有极大的异质性。在其发生发展过程中,肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤持续生长的主要原因。而EMT与肿瘤转移紧密相关,科学家大胆猜测并验证原发瘤来源的CTCs是一个异质性极高的群体,该群体中可能包含不同表型的亚群。不同亚群的CTCs可能具有不同的生物学特征,如EMT样CTCs、CSCs样CTCs和转移起始细胞(metastasis initiate cells,MIC)样CTCs。器官靶向性转移的CTCs和耐药相关CTCs直接与肿瘤转移及耐药相关。

2012年,关于胰腺癌的研究发现,在胰腺原位癌形成之前,肿瘤细胞发生EMT进入血液循环,定植在肝脏中,最终形成转移灶[30],说明EMT在肿瘤转移过程中发挥重要的作用。对EMT的进一步研究发现,间质型的肿瘤细胞容易进入血管但是不易发生远端转移[31-32],大家逐渐认为介于上皮性和间质型的肿瘤细胞可能具有肿瘤干细胞样的特征[33]。那么,是否可以根据E型或M型标记物来鉴定CTCs亚群呢？2013年Yu等[34]对11个乳腺癌患者CTCs进行检测,发现很少有细胞同时表达E-M型,在跟踪一例患者治疗过程中CTC表型的动态变化时,发现E-M表型的比例随着患者疾病状态发生改变。其中间质型CTCs在患者疾病进展期比例明显增高,在间质细胞团簇中发现高表达的TGF-β,血小板分泌TGF-β促进肿瘤细胞向间质型转变,而血小板在肿瘤的着床黏附的过程中发挥重要的作用; 这提示在肿瘤进展中M-型的CTCs可作为耐药标志物和新的治疗靶点。Baccelli等[35]发现在与乳腺癌患者预后更具相关性的是EpCAM+CD44+CD47+MET+CTCs,而不是所有的EpCAM+CTCs,同时在小鼠模型中证实EpCAM+CD44+CD47+MET+CTCs具有更强的肿瘤形成能力和远端转移能力。前期研究表明,肿瘤的转移具有器官偏好性,CTCs的分群将来可用于转移病灶的确定。2013年,Zhang[36]从乳腺癌患者的CTCs中鉴定出EpCAM-HER2+/EGFR+/HPSE+/Notch1+CTCs具有特异性脑部转移。2015年,在结直肠癌中,发现CD110+的肠癌干细胞有非常强的靶向转移到肝脏的潜能[37]。

在CTC的基因水平上,对转移性前列腺癌的CTCs进行全外显子测序发现CTCs中仅70%的突变发生在原发瘤和淋巴转移样本,而在CTCs中可发现原发瘤和淋巴转移样本中90%的驱动突变和转移相关突变,提示CTCs可能作为新的治疗靶点[38]。同年Yu等[39]在乳腺癌中也发现CTCs比原发肿瘤具有更多的新增突变,根据突变结果进行药物敏感测试发现,CTCs细胞系的药物敏感程度与患者一致,不同的突变特征对同一治疗方案的敏感程度不同,提示CTCs的基因突变信息可指导肿瘤患者的治疗方案的选择。在非小细胞肺癌和转移性结直肠癌中均发现CTCs的突变位点能够很大程度上覆盖原发灶和转移病灶的突变。

根据患者CTCs的DNA信息可以指导精准医疗,那么根据RNA的信息是否能起到相同的作用?2012年在小鼠胰腺癌模型的外周血CTCs中发现Wnt2高表达,抑制细胞的失巢凋亡,促进细胞的非依赖性增长[40]。最近Miyamoto等[41]通过对前列腺癌患者CTCs单细胞RNA测序发现,Wnt5a异常高表达减弱了AR抑制剂的抗增殖效应,从而引发AR阳性细胞耐药,导致患者治疗失败。

结语综上,相较于常规的肿瘤诊断途径包括组织病理学分析和高分辨率在体成像技术,CTCs的检测可无创取样,并可实时监测患者病情。目前除了对CTCs的检测技术和生物学特性的研究外,还有体外创建CTCs细胞系[42],利用CTCs来源的小鼠肿瘤模型和类器官模型[43]进行药物敏感性的预临床试验和药物敏感性分析[44]的探索。对CTCs的检测与生物学特性的分析将有助于肿瘤患者早期转移的诊断、辅助精确临床分期、实时监测术后患者肿瘤复发与转移、评估预后及合理地选择个体化的治疗策略。

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The biological characteristics and significance of circulating tumor cells in patients with solid malignancies

ZHANG Kai-li2,GAO Xiao-mei2,QIN Lun-xiu1,2,3△

(1DepartmentofGeneralSurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2CancerMetastasisInstitute,FudanUniversity,Shanghai200040,China；3InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】Circulating tumor cells (CTCs) are necessary for tumor recurrence and distal metastasis.With the development and progress in the detection technologies of CTCs,more and more attentions have been focused on the biological characteristics and their potential clinical application of CTCs.Cumulating evidence suggests that CTCs are closely related to the prognosis of cancer patients,and may be used in personized cancer treatment.

【Key words】circulating tumor cell;tumor metastasis;cancer therapy

【中图分类号】R 730

【文献标识码】B

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.017

(收稿日期:2015-11-06;编辑:张秀峰)

△Corresponding authorE-mail:qinlx@fudan.edu.cn