惠州市冬种马铃薯卷叶病毒病的发生、鉴定及气象影响因子研究

陈兆贵，张 蒙，肖军委，胡成来（.惠州学院生命科学系，广东 惠州 56007；.广东九华马铃薯产业有限公司，广东 惠州 56007）



惠州市冬种马铃薯卷叶病毒病的发生、鉴定及气象影响因子研究

陈兆贵1，张 蒙1，肖军委2，胡成来2
（1.惠州学院生命科学系，广东 惠州 516007；2.广东九华马铃薯产业有限公司，广东 惠州 516007）

摘 要：以惠州冬种马铃薯为研究对象，探索不同气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒的影响。以田间调查的形式统计了不同时期冬种马铃薯卷叶病毒的发病情况，并对马铃薯卷叶病毒进行分子鉴定，分析了惠州市冬季气温、相对湿度及降水等气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒病的影响。结果表明：3次调查马铃薯卷叶病毒病的平均发病率依次为2.48%、12.6%、70.18%，呈上升趋势；分子鉴定结果显示确为马铃薯卷叶病毒的感染；气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒的发生有着重要的影响，其中高温、少雨，相对湿度在70%～80%的气象条件易造成马铃薯卷叶病毒病的发生和传播。

关键词：马铃薯卷叶病毒；气象条件；影响；RT-PCR

马铃薯是是继水稻、玉米和小麦之后的世界第四大粮食作物，是一种重要的经济兼粮食作物；我国是世界马铃薯生产第一大国，种植面积约460万hm2，占世界马铃薯生产总面积25%；产量约6 000万t，占世界马铃薯总产量的20%［1］。

惠州市地处广东省东南部，属亚热带季风气候，北回归线横穿中部，日照时间长，热量丰富，雨量充足，发展冬种马铃薯具有得天独厚的自然优势［2］，2013年种植面积已达1万hm2。随着冬种马铃薯种植面积的扩大，马铃薯卷叶病毒发病情况已日益严重。影响马铃薯卷叶病发生和流行因素有许多，主要包括马铃薯种薯带毒、气象条件和田间管理措施等。气象条件对马铃薯卷叶病毒的发生有着重要的影响。由于广东省冬季气温高、湿度大，蚜虫飞迁传播病毒使马铃薯卷叶病毒侵染速度更快，再加上冬种马铃薯生产中后期受霜冻和阴雨的影响，产量本身就不高。因此，一旦染病往往导致严重减产甚至失收［3］。

国内外关于气象条件对冬种马铃薯卷叶病毒影响的研究不多［3-5］。黄新碧等［3］指出，影响广东冬种马铃薯种植的主要气象因子是1月的低温霜冻和2月中旬开始的春雨过多，尤其是高温高湿的天气。笔者拟通过不同时期冬种马铃薯卷叶病毒发病情况的调查，总结出惠州马铃薯冬种季节的气温、湿度及降水等气象条件对马铃薯卷叶病毒发生的影响，为防控马铃薯卷叶病毒病的发生提供依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试马铃薯品种费马瑞它种植于惠州市惠东县平海镇大水坑、径口村、官田村，磜头村和铁涌镇溪美村的马铃薯基地，播种时间均为2013年11月。从田间采集疑似感染马铃薯卷叶病毒病的植株，同时采集健康植株作为对照，储存于超低温冰箱（-86℃左右）中备用。

1.2试验方法

1.2.1田间调查法 调查地点为惠东县平海镇的大水坑、径口村、磜头村、官田村和铁涌镇溪美村。根据马铃薯的生长周期，分别于2014年1月7日、19日，2014年2月17日进行调查。每个种植点随机抽取3块田地，采取五点取样的方法，调查100株马铃薯植株，即每个地点共调查300株，统计疑似感染马铃薯卷叶病毒病的植株数量。

1.2.2RNA提取及引物设计 采用试剂盒法提取材料的总RNA，通过凝胶电泳检测RNA提取效果。根据已有的马铃薯卷叶病毒的基因序列及其保守序列的报道设计1对引物［6］，P1和P2引物序列分别为5′-ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAG-3′，5′-CTATTTGGGGTTTTGC AAAG-3′，扩增片段长度为627 bp，由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2.3反转录 （1）变性、退火反应体系（10.0 μL）：dNTP Mixture 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Template RNA 5.0 μL，RNase Free ddH2O 3.0 μL。（2）变性、退火反应程序：变性65℃ 5 min，退火4℃ 15 min。（3）反转录反应体系（20.0 μL）：变性、退火后反应液 10.0 μL，5×RT Buffer 4.0 μL，RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor 40 U/μL） 0.5 μL，RNA反转录酶（PrimeScriptTM RTase ）1.0 μL，RNase Free ddH2O 4.5 μL。（4）反转录反应程序：45℃ 45 min，95℃ 5min，4℃15 min。

1.2.4PCR扩增 （1）PCR反应体系（50.0 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，特异上游引物0.5 μL，特异下游引物0.5 μL，Taq DNA polynarase 0.5 μL，反转录反应液2.0 μL，RNase Free ddH2O 39.5 μL。（2）PCR扩增反应程序：94 ℃预变性1 min；94℃变性30 s， 60℃复性30 s，72℃延伸1 min，40个循环；72℃延伸10 min， 4℃ Forever。对PCR扩增产物进行电泳检测，并测序。

1.2.5马铃薯卷叶病毒发生与气象条件的关系 根据田间调查的时间以及马铃薯的生长周期特点，前期以一个月为一个周期，中后期以10 d为一个周期，将这几个时间段马铃薯主产区的气象条件与马铃薯卷叶病毒病的发生情况进行相关性分析。

2　结果与分析

2.1马铃薯卷叶病毒发生情况调查

从表1中可以看出，前期调查中，每块田地只有零星的几株马铃薯感染了卷叶病，第一次调查时发病率均在4%以下；但随着时间的推移，到中后期马铃薯卷叶病迅速蔓延，各田块的发病率均超过了50%，感病严重的田块发病率甚至高达90%以上。

表1　马铃薯卷叶病毒病田间发病情况调查

如图1所示，采用试剂盒法提取的RNA在电泳时呈现出清晰的3条带，从上至下依次为28 S rRNA、18 S rRNA、5 S rRNA，说明提取的RNA比较完整，可用于后续试验。

图1　RNA电泳检测结果

2.3RT-PCR扩增结果

如图2所示，健康植株中提取的RNA未扩增出特异性条带，而感染了马铃薯卷叶病的植株RNA扩增出目的条带，大小在500 ～750 bp之间，与目标片段627 bp相一致。

图2　RT-PCR扩增结果

2.4PCR扩增产物测序

PCR 产物由大连宝生物工程有限公司进行纯化测序，测序结果为627 bp 片段，与设计的结果一致，扩增的片段序列如下：ATGAGTACGGTCGTGGTTAA AGGAAATGTCAATGGT GGTGTACAACAACCAAGA AGGCGAAGAAGGCAATCCCTTCGCAGGCGCGCTA ACAGAGTTCAGCCAGTGGTTATGGTCACGGCCCC TGGGCAACCCAGGCGCCGAAGACGTAGAAGAGG AGGCAATCGCCGCTCAAGAAGAACTGGAGTTCCC CGAGGACGAGGCTCAAGCGAGACATTCGTGTTTA CAAAGGACAACCTCATGGGCAACTCCCAAGGAA GTTTCACCTTCGGGCCGAGTCTATCAGACTGTCCG GCATTCAAGGATGGAATACTCAAGGCCTACCATGA GTATAAGATCACAAGCATCTTACTTCAGTTCGTCA GCGAGGCCTCTTCCACCTCCTCCGGCTCCATCGCT TATGAGTTGGACCCCCATTGCAAAGTATCATCCCT CCAGTCCTACGTCAACAAGTTCCAAATTACGAAG GGCGGCGCCAAAACTTATCAAGCGCGGATGATAA ACGGGGTAGAATGGCACGATTCTTCTGAGGATCAG TGCCGGATACTGTGGAAGGGAAATGGAAAATCTTC AGATACCGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATCAGGG TGGCTTTGCAAAACCCCAAATAG。经序列分析和同源性比较，确认这个序列就是马铃薯卷叶病毒（PLRV）基因组序列片段。

2.5马铃薯卷叶病毒发生与气象条件的关系

2.5.1马铃薯卷叶病毒发生与温度的关系 从表2中可以看出，2013年12月的平均气温为13.8℃，比较稳定；2014年1月1～10日的平均气温为15.4℃，气温出现了小幅度的上升，一些植株开始患病；接下来两个时间段的平均温度分别为12.3、13.6℃，气温恢复到12月时的温度，都保持在13℃左右，比较稳定，发病率较之前稍微有一些上升；而2014年1月31日至2月9日的平均气温由之前的12.3℃上升到16.4℃，最高温度达到22℃左右，之后又大幅度地降温，平均气温只有11℃，最低温达到了8.7℃，这种短时间内的冷热交替天气使得马铃薯植株的自身防御能力大大降低，进而导致卷叶病毒病大面积爆发，植株感病率大幅度上升。

2.5.2马铃薯卷叶病毒发生与相对湿度的关系 由表2可知，在马铃薯生长发育阶段，惠州市的空气相对湿度总体上表现为上升趋势，但变化并不大，均在70%～85%范围内，比较较稳定。在田间调查的前期（2014年1月1日），相对湿度为75.1%左右，田间感染马铃薯卷叶病毒病的植株非常少，只有零星的几株；田间调查中期相对湿度维持在78.5%上下，田间的病株增至30～40株，卷叶病发病率小幅度上升到12.6%；而到后期相对湿度达到80%以上，田间的马铃薯卷叶病发病率高达90%。由此可知，随着时间的推移，空气相对湿度有所提高，而马铃薯卷叶病的发病率也有不同程度的上升，表明马铃薯卷叶病毒发生与相对湿度之间存在一定相关性。

表2　马铃薯生长周期的气象条件

2.5.3马铃薯卷叶病毒发生与降水的关系 如表2所示， 2013年12月惠州地区的降雨相对较多，而其他时间段降雨非常少，有时连续10 d不曾下雨。3次的田间调查发现，前期的总降水量为1.2 mm，田间感病植株只有零星的几株；中期的降水量仅为0.2 mm，卷叶病发病率有所上升；后期总降水量为1.0 mm，而马铃薯卷叶病毒迅速蔓延传播，发病率高达90%。虽然各段时间的降水量有一些小差异，但近3个月的总降雨量仅为2.2 mm，非常少。因此，干旱少雨的气象环境对马铃薯卷叶病毒病的发生和传播有一定的影响。

2.5.4马铃薯卷叶病毒发生与日照的关系 如表2所示，在调查期间， 以1月11～20，21～30这两个时间段的日照最强，总幅射分别达到31 920和35 201 W/m2，而2月10～19日，日照总幅射只有13 791 W/m2，比1月大大降低，加之同时期气温过低，马铃薯生长缓慢也是马铃薯卷叶病毒病流行的原因之一。

3　讨 论

影响马铃薯卷叶病毒病发生与流行的因素很多，如种薯带毒、栽培管理、气象条件及蚜虫的数量等。影响惠州冬种马铃薯卷叶病毒病发生的气象因素包括温度、降雨量、日照、相对湿度等。贾小琴等［7］研究指出日照和降水条件是引起临夏地区马铃薯病毒病发生的关键气候因子。在惠州冬种季节，降水一直较少，马铃薯种植主要通过田间灌水方式保证马铃薯正常生长所需。因此，降水与马铃薯卷叶病毒病发生之间的关系并不密切。日照和气温对马铃薯卷叶病毒的发生有重要的影响，如果处于低温和日照不足的环境，马铃薯生长速度减慢，有可能导致马铃薯卷叶病毒病的流行。

气象条件除了直接影响马铃薯卷叶病毒的发生以外，还有一个重要的方面是影响蚜虫的数量。马铃薯卷叶病毒主要通过蚜虫以持续性方式传播，其中桃蚜是传播该病毒的主要中间介体。虽然种薯带毒率影响着田间初始病株的数量，但蚜虫数量仍是马铃薯生长后期发病率的决定性因素。多数蚜虫适宜生长温度在14～25℃之间，而马铃薯喜阴凉，不耐高温，25℃以上高温会降低宿主对病毒的抵抗力，也有利于传播媒介蚜虫的繁殖、迁飞和传病，从而有利于该病蔓延，加重受害程度［7］。惠州地区在1月1～10日气温有小幅度回升，1月31日至2月9日气温有大幅度提升，均导致后期马铃薯卷叶病毒病的大规模发生。虽然伴随升温后马上有降温，蚜虫传播没有之前迅速，但是马铃薯植株本身对这种高低温的急剧变化也不适应，一方面降低了宿主对病毒的抵抗力，另一方面还可能引发其他病虫害。

在湿度较大的情况下，植物生长旺盛，蚜虫对植物的危害相对较小；相对湿度较小时，植物对吸汁性害虫较为敏感，易发生萎蔫，同样的虫口密度，造成的危害相对较大。相对湿度在50%～80%之间时，蚜虫生长发育良好，当高于90%或低于35%时，不利于蚜虫生长繁殖［8］。该研究也表明，在田间调查期间，虽然相对湿度总体上呈上升趋势，但基本维持在70%～85%左右，均在蚜虫的适宜范围内，这也为马铃薯卷叶病毒病的发生提供了有利的环境。因此，田间的蚜虫繁殖快，数量大，危害重。

参考文献：

［1］ 伍壮生，张西露，刘明月. 南方冬作马铃薯产业发展与对策建议［J］.辣椒杂志，2010，（4）：41-43.

［2］ 陈兆贵，林于绵，黄 成. 冬种马铃薯卷叶病田间调查及RT-PCR检测技术研究［J］. 湖北农业科学，2010，49（9）：2134-2137.

［3］ 黄新碧，陈朝庆. 利用自然条件和地理优势发展发展马铃薯生长［J］.马铃薯杂志，1994，8（4）：235-238.

［4］ 韦剑峰，吴炫柯，韦冬萍，等. 广西冬种马铃薯的气候条件分析［J］.安徽农学通报，2011，17（23）：155-157.

［5］ 罗森波. 广州冬种马铃薯气候适宜性分析与区划［J］. 广东气象，1992，（4）：25-27.

［6］ 何心凤，郭宝太，李广存，等. 马铃薯卷叶病毒CP基因的RTPCR扩增［J］. 中国马铃薯，2007，21（4）：197-199.

［7］ 贾小琴，刘治国，傅正涛，等. 临夏地区近43年来的日照时数变化分析［J］. 江苏农业科学，2013，（2）：354-358.

［8］ 李 慧. 温湿度降水对蚜虫发生的影响［J］. 新疆气象，1989，（6）：25-26.

（责任编辑：成 平）

Occurrence， Identification and Meteorological Influence Factors of Winter-Planting Potato Leaf Roll Virus Disease in Huizhou City

CHEN Zhao-gui1，ZHANG Meng1，XIAO Jun-wei2，HU Cheng-lai2
（1. Huizhou University， Department of Life Sciences， Huizhou 516007， PRC；2. Guangdong Jiuhua Potato Industry Co.，Ltd ， Huizhou 516300， PRC）

Abstract：in order to study the effects of different meteorological conditions on the leaf roll virus of winter-planting potato in Huizhou province. In the form of field survey investigated in different periods of winter-planting potato roll leaf virus incidence， and identified potato leaf roll virus molecular， analyzed the Huizhou City winter air temperature， relative humidity， precipitation and other meteorological conditions effects to winter-planting potato leaf virus disease. The results showed that the average incidence rate of potato leaf roll virus disease was 2.48%， 12.6%， 70.18%， and it was increased in 3 times investigation； the results of molecular identification showed that the infection of potato leaf roll virus was indeed； meteorological conditions have important effects on the occurrence of winter-planting potato leaf roll virus， including high temperature and little rain， the relative humidity in 70%～80% are the meteorological conditions that easy to cause the occurrence and propagation of potato leaf roll virus.

Key words：potato leaf roll virus； meteorological conditions； influence； RT-PCR

中图分类号：S435.32

文献标识码：A

文章编号：1006-060X（2016）03-0065-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.03.021

收稿日期：2016-01-26

基金项目：广东省教育厅科技创新项目（KJCX0176）；广东省科技计划项目（2013B090200023）

作者简介：陈兆贵（1973-），男，广西蒙山县人，教授，主要从事作物遗传育种研究。