慢阻肺大鼠肺组织中树突状细胞表面因子的表达变化及CCL20抗体的干预作用

孙得胜，欧阳瑶，顾延会（.遵义医学院附属医院呼吸一科，贵州遵义 563003；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，卫生部呼吸系统疾病重点实验室，武汉 430030）



慢阻肺大鼠肺组织中树突状细胞表面因子的表达变化及CCL20抗体的干预作用

孙得胜1，2，欧阳瑶1，顾延会1
（1.遵义医学院附属医院呼吸一科，贵州遵义 563003；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，卫生部呼吸系统疾病重点实验室，武汉 430030）

【摘要】目的 了解树突状细胞表面因子OX62、CD83在慢阻肺大鼠肺部的表达变化，并探讨CCL20抗体的干预作用。方法 选用30只健康Wistar大鼠，随机分为健康对照组（10只）、慢阻肺模型组（10只）、CCL20单抗组（10只），用气道内注入脂多糖（共2次）联合烟雾刺激（约28 d）的方法诱导慢阻肺模型。在实验初始对单抗组大鼠以CCL20单克隆抗体腹腔注射一次。在第29天取大鼠的肺组织观察其病理学改变，用免疫组织化学技术检测肺部树突状细胞（DC）的表面因子OX62、CD83的表达变化。结果 模型组大鼠肺组织HE染色符合气道炎症和肺气肿的表现，CCL20单抗组大鼠肺部病理表现比慢阻肺组明显减轻。与健康对照组相比，慢阻肺模型组大鼠的肺组织中OX62的表达比对照组明显增多（P＜0. 05），而在CCL20单抗组低于慢阻肺组（P＜0. 05）。慢阻肺模型组大鼠肺组织中CD83的表达比对照组少（P＜0. 05），而在慢阻肺组与CCL20单抗组之间则没有明显的差异（P＞0. 05）。结论 慢阻肺的发病可能与肺部OX62的表达增多及CD83的表达减少有关，使用CCL20单抗能部分地抑制这一效应。

【关键词】慢阻肺；树突状细胞；CCL20单抗；OX62；CD83

自1679年Bonet以“庞大容量的肺”描述慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺，COPD）到近年GOLD （The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，慢阻肺全球倡议）对慢阻肺最新定义的认识，气道和肺组织对有害气体或颗粒的异常炎症反应被认为是其重要特征［1］，且越来越多的研究提示慢阻肺也可能是一种自身免疫性疾病［2］，有学者发现在其发病过程中有免疫细胞被募集到肺［3］。慢阻肺中的免疫应答是在特定的抗原驱使下完成的［3－4］，同时它受到树突状细胞（dendritic cell，DC）的严密调控［5－6］。DC环绕气道形成敏感的防御体系，在外来抗原侵袭机体时，它们从完好的上皮组织移行到受侵袭的部位并摄取这些抗原［7］，DC表面受体在信号刺激下介导了此过程［8］。DC继续迁移到局部引流淋巴结，提呈所摄取的抗原给相关的T细胞。相应的炎症反应就是在这些T淋巴细胞的介导下发生的。DC的迁移是趋化作用的结果，在它们的趋化因子与相关的受体间的相互作用下完成［9］。CCL20是未成熟树突状细胞（immature DC，iDC）的主要趋化因子，当气道发生炎症反应的时候，表达于气道上皮的CCL20大量增加［10］，它与受体间的相互作用被认为是iDC被募集于气道的一个可能的重要机制。

我们通过香烟烟雾刺激和气道内注入细菌内毒素脂多糖（LPS）制备大鼠慢阻肺模型，分别检测DC的表面因子OX62和CD83在肺组织中的表达，并通过阻断CCL20观察抗CCL20干预对慢阻肺大鼠的治疗效果。

1　材料和方法

1. 1 实验材料

清洁级Wistar雄性大鼠（共30只），鼠龄8周，体重200～220 g，由重庆市第三军医大学大坪医院实验动物中心提供【SCXK（渝）2014－0005】。二部法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒（上海基因科技公司），小鼠抗大鼠OX62单克隆抗体（美国R&D Systems公司），兔抗-CD83多克隆抗体（北京博奥森生物技术公司），大鼠CCL20单克隆抗体（美国R&D Systems公司），羊抗鼠IgG-HRP（北京爱普华美生物科技公司），脂多糖（美国Sigma公司），香烟（黄果树牌，烟气烟碱1. 0 mg焦油11 mg一氧化碳量13 mg贵州中烟工业有限公司）。

1.2模型的建立

实验在遵义医学院进行【SYXK（黔）2014－003】将大鼠随机分为健康对照组、慢阻肺模型组和CCL20单抗干预组（每组10只）。使用香烟烟雾刺激和气道内注入脂多糖的方法制备慢阻肺模型［11］：后两组大鼠于第1天和第15天气道内注入脂多糖溶液（200 μg/200 μL）；第2～28天（第15天除外）于造模箱（由玻璃制成，25 cm×35 cm×80 cm，箱顶有直径约2 cm的通气孔，箱中部从下向上有两排铁网，铁网间摆放并点燃香烟）内被动吸烟（每天2次，每次燃12支香烟）。当日2次被动吸烟造模间隔2 h，健康对照组不予上述处理。CCL20单抗组大鼠第1天注脂多糖前用CCL20单克隆抗体（100 μg/只）腹腔注射。

1.3标本采集

第29天分别选取两组大鼠麻醉后开胸，剪取左肺予多聚甲醛固定，制作石蜡标本及病理切片，并行HE染色及免疫组化实验。取右肺各叶放入低温冷冻管，并保存备用。

1.4指标检测

观察模型组大鼠肺组织HE染色切片是否有慢支炎、肺气肿的病理表现，CCL20单抗组的病理改变是否有所减轻。免疫组化实验的切片于光镜下选阳性表达最强的5个视野，计算机采图后输入软件IPWIN 60中分析，计算积分值光密度（IOD），每幅图使用此软件分析3次。在同一切片中随机选取5个不同视野，分别测得积分光密度值，以其平均值代表样本中OX62或CD83的表达水平。

1.5数据分析

2　结果

2.1三组大鼠肺组织的病理表现

对照组：肺泡结构完整连续，未见炎性细胞浸润，符合正常肺组织病理表现。慢阻肺模型组：肺泡间隔内可看到毛细血管扩张充血，伴炎性细胞浸润，部分肺泡间隔断裂、融合，呈“慢支炎、肺气肿”改变，符合慢阻肺的典型病理特点。CCL20单抗组：肺泡间隔增宽，伴有炎细胞浸润，部分肺泡腔略扩大，但病变程度明显比慢阻肺组减轻（图1）

图1　肺组织病理表现（×10）Note：A（controls）；B（COPD models）；C（CCL20 monoclonal antibody treated group）.Fig. 1 Photomicrographs of haematoxylin and eosin stained lung tissue（×10）

2.2三组大鼠肺组织中OX62和CD83的表达

OX62和CD83的免疫组化阳性染色主要表达于DC的胞浆，广泛分布于肺泡以及气道周围的相关淋巴组织和血管附近。慢阻肺模型组大鼠的肺组织OX62表达比对照组显著增多（P＜0. 05），而CCL20单抗组的OX62表达比慢阻肺模型组显著减少（P＜0. 05）。慢阻肺模型组大鼠的肺组织中CD83的表达比健康对照组显著减少（P＜0. 05），而与CCL20单抗组相比，无明显差异（P＞0. 05）（图2/表1）

表1　OX62和CD83在三组大鼠肺组织中的表达（n =10）Tab. 1 Expression of OX62 and CD83 in lung tissues of rats in the three groups（n =10）

3　讨论

慢阻肺是一种严重危及人类健康的气道慢性炎症性疾病，具有病程长、难治愈、易复发的特点，以逐渐进展、不完全可逆的气流受限为特征［12］，吸烟和感染被公认是引起它发生发展的最主要的环境因素。我们对大鼠进行烟雾刺激并注射脂多糖诱发感染以模拟这种病理生理过程，4周后模型组大鼠肺组织病理表现与早期文献报道一致［11－13］，符合慢阻肺肺组织的典型病理特点，CCL20单抗干预组大鼠肺组织的病理改变比慢阻肺模型组显著减轻。

本实验显示，慢阻肺模型组大鼠肺组织中DC的表面因子OX62的表达比对照组显著增加。OX62是大鼠DC的标志物［14］，CCL20是未成熟DC （immature DC，iDC）的趋化因子［15］，当气道发生炎症反应的时候，在CCL20等趋化因子作用下，部分iDC向肺部迁移［16］，故而引起肺部DC增多、OX62的表达增加。实验还发现CCL20单抗组OX62的表达比慢阻肺模型组减少（P＜0. 05），这很可能由于部分CCL20与注射到体内的CCL20抗体结合，从而使对DC发挥趋化作用的CCL20减少，使肺部OX62的表达减少，同时也使病情减轻。

本研究显示，慢阻肺模型组大鼠的肺组织中CD83的表达比健康对照组显著减少。CD83是成熟DC（mDC）的标志物［17］，这也许与肺部mDC在慢阻肺的发病过程中向局部引流淋巴结发生迁移有关［18］。CCL20单抗组与慢阻肺模型组相比，CD83在肺组织中的表达无明显差异（P＞0. 05）。考虑到CCL20是iDC的趋化因子，而mDC的迁移在其他趋化因子的作用下完成，故单抗组大鼠体内注入CCL20单抗后并未对mDC产生直接影响，从而该组大鼠肺组织中CD83的表达与慢阻肺组无明显差异。

综上所述，我们通过实验发现慢阻肺的发病可能与肺部OX62表达的增多及CD83表达的减少有关，使用CCL20单抗干预治疗能部分地缓解这种改变，从病理结果来看，其对慢阻肺的气道炎症及病理损害过程有一定的抑制或延缓作用。

图2　各组大鼠免疫组化染色表现（×20）Note：A.OX62 expression in the controls；B. OX62 expression in the COPD models；C. OX62 expression in the CCL20 monoclonal antibody treated group；D. CD83 expression in the controls；E.CD83 expression in the COPD models；F.CD83 expression in the CCL20 monoclonal antibody treated group.Fig. 2 Immunohistochemical staining of the rats in each group（×20）

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〔修回日期〕2016－01－25

Expression of the surface factors of dendritic cells in the lung tissues of rats with COPD and the effect of CCL20 antibody on it

SUN De-sheng1，2，OUYANG Yao1，GU Yan-hui1
（1. Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2. Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Key Laboratory of Pulmonary Diseases of Health Ministry，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China.）

【Abstract】Objective To understand the expression of OX62 and CD83 in the lungs of rats with COPD，and to investigate the effect of the CCL20 monoclonal antibody on it. Methods A total of 30 rats were randomly divided into three groups：normal，model，and CCL20 antibody treated. COPD was induced by cigarette smoke exposure 28 days and LPS solution injection twice. The rats were injected with CCL20 antibody in the last group on the first day. The rats were sacrificed on the 29th day. We investigated the pathomorphology of their lungs by HE staining and evaluated the DC distribution in their lungs by immunohistochemistry. Results The HE staining results of the COPD models are consistent with the typical pathological features of COPD patients，the lung pathology in CCL20 group was significantly attenuated thanthat in the COPD group. Compared with healthy control group，the OX62 + DCs in the COPD model group was significantly increased（P＜0. 05），and the CCL20 group was lower than that in the COPD group（P＜0. 05）. The CD83 + DCs of COPD group was lower than that in healthy control group（P＜0. 05），and the difference was not statistically significant between COPD and CCL20 treated group（P＞0. 05）. Conclusion The pathogenesis of COPD may be related to the increase of OX62 + DC and the decrease of CD83 + DC，and this effect could be partly inhibited by CCL20 antibody.

【Key words】COPD；Dendritic cell；CCL20 antibody；OX62；CD83

【中图分类号】］R563. 3 R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856（2016）03-0011-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 003

［基金项目］国家自然科学基金（81460008）。

［作者简介］孙得胜（1980－），男，主治医师，博士生，主要研究方向：慢性阻塞性肺疾病的发病机制。E-mail：sun_desheng@163. com。

［通讯作者］欧阳瑶（1965－），女，主任医师，教授，主要研究方向：慢性阻塞性肺疾病的基础与临床。E-mail：ouyangyao116@ sohu. com。