脊髓损伤后星型胶质细胞活化与线粒体融合蛋白2表达变化

李长丽,郑　莉，蒋　猛，易成腊，白祥军

430015 湖北 武汉，湖北省中西医结合医院老年病科(李长丽，郑莉)； 430030 湖北 武汉，华中科技大学同济医学院



·论著·

脊髓损伤后星型胶质细胞活化与线粒体融合蛋白2表达变化

李长丽,郑莉，蒋猛，易成腊，白祥军

430015 湖北 武汉，湖北省中西医结合医院老年病科(李长丽，郑莉)； 430030 湖北 武汉，华中科技大学同济医学院

【摘要】目的探索脊髓损伤后星型胶质细胞(AS)活化与线粒体融合蛋白2(Mfn2)的表达规律及其意义，为脊髓损伤修复寻求合适的干预靶点及时机。方法建立成年SD大鼠脊髓损伤(SCI)模型，运用免疫荧光和Western Blotting方法，检测Mfn2及AS活化相关蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化。清洁级成年雄性SD大鼠48只，随机分为两组：假手术组(sham组，n=24)，脊髓损伤组(SCI组，n=24)，SCI组采用Allen’s法建立大鼠胸段脊髓损伤模型，sham组只行椎板切除术，分别于术后第1天、第3天、第7天、第14天4个时间点分批处死大鼠，取大鼠胸段脊髓组织，行组织免疫荧光染色观察脊髓形态变化，Western Blotting检测各个时间点Mfn2与GFAP的表达变化。结果脊髓损伤后，大鼠胸段脊髓灰质两背角之间会形成结构紊乱、边界不清的损伤灶；Western Blotting及免疫荧光结果显示脊髓损伤后，大鼠胸段脊髓Mfn2蛋白表达从第1天开始下降，与sham组相比，脊髓损伤组胸段脊髓Mfn2表达整体呈下降趋势，术后第3天开始明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；而GFAP表达随时间延长则逐渐增加，术后第3天开始差异有统计学意义(P<0.05)。结论脊髓损伤后，AS的特异性标志物GFAP表达整体呈上升趋势，提示此时AS出现大量增殖；与此相反，Mfn2(增殖抑制基因)表达产物则明显减少。

【关键词】脊髓损伤； 线粒体； 胶质细胞； 蛋白； 大鼠

影响脊髓损伤后神经功能恢复和轴突再生的因素主要包括两方面：损伤脊髓周围存在不利细胞生存的内环境及哺乳动物成熟神经元内在再生能力的减弱，其中胶质瘢痕形成及其含有的多种抑制因子是影响轴突再生的重要外部因素。众多的实验研究表明，星形胶质细胞活化是形成胶质瘢痕的重要因素[1-2]。

线粒体融合蛋白(mitofusions,Mfn) 参与线粒体膜融合过程，在维持线粒体形态和功能中起重要作用。Mfn在哺乳动物中编码Mfn1和Mfn2两种蛋白质分子,Mfn2又名增殖抑制基因(hyperplasia suppressorgene,HSG),是我国学者陈光慧利用差异显示技术发现的一个新基因[3],其功能除介导线粒体融合外，还参与了细胞的能量代谢、信号转导、增殖及凋亡等众多细胞生物学过程。据文献报道，Mfn2能够通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK1/2信号通路的激活，增加周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CKls)P27、P21的表达，从而使血管平滑肌细胞停留在G0/G1期。而脊髓损伤修复过程亦涉及胶质细胞异常增殖，并且Mfn2在星形胶质细胞内有较高的表达，笔者推测其功能状态或许与脊髓损伤后星形胶质细胞活化密切相关。因此本实验拟通过大鼠的脊髓损伤模型探索Mfn2在脊髓损伤后的表达变化，观察其与星形胶质细胞活化的相关性，以期为脊髓损伤修复治疗提供新的视角。

材料与方法

1实验动物及其分组

清洁级成年雄性SD大鼠48只，体重250～350g，均购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，分笼喂养，自由饮食水，并且保持自然昼夜节律。动物模型制备前禁食水12h。实验动物随机分为假手术组(sham组，n=24)，脊髓损伤组(SCI组，n=24)。动物实验经华中科技大学实验动物伦理委员会批准。

2动物模型的建立和时间点设定

脊髓损伤组采用改良的Allen’s法建立脊髓损伤模型[4]，使用10%水合氯醛，以4mL/kg剂量腹腔注射麻醉，麻醉满意后大鼠俯卧位固定，对背部拟行切口处皮肤剪毛、消毒、铺巾，作4cm长的纵行皮肤切口，分离各层皮下组织暴露T10椎体，咬除棘突及椎板暴露T10脊髓。以后正中血管为中心，将重10g的金属棒从40mm高处垂直自由下落撞击硬脊膜，造成T10段脊髓冲击损伤，损伤直径约为3mm，局部采用无菌棉球止血，逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤。损伤模型成功的标志是：金属棒撞击脊髓时，大鼠身体抖动，双下肢迅速回缩并弹起扑动，尾巴翘起并迅速倒下。sham组只做椎板切除，不行脊髓损伤打击。所有大鼠术后均应用抗生素，以每只3万U/次，2次/d的剂量腹腔注射青霉素(由同济医院药剂科提供)，连续3d。术后软食喂养，定时行挤压排尿。分别在术后4个时间点，即第1、3、7、14天取大鼠胸段脊髓组织。

3取材及冰冻切片制备

各时间点将大鼠麻醉后暴露心脏，经左心室快速灌注生理盐水约300mL直至流出澄清液，然后使用4%多聚甲醛灌注固定约1h后，取以损伤为中心长约5mm的胸段脊髓组织，置于4%多聚甲醛液体中后固定4℃过夜，30%蔗糖溶液中脱水48h。冰冻切片包埋胶(OCT胶)包埋，冰冻切片机切片，切片厚度20μm，所切标本放入-20℃冰箱保存备用，用于免疫荧光染色。

4组织免疫荧光染色

从-20℃冰箱取出片子→置入电热恒温鼓风干燥箱晾干→将脊髓标本所在位置用组化笔圈起来→磷酸缓冲盐(PBS)溶液水平摇床上5min/次清洗3次→破膜;0.3%Triton 液室温破膜15min→PBS溶液水平摇床上5min/次清洗2次→封闭；正常山羊血清封闭液室温下封闭40min→孵育一抗；按1∶200稀释Mfn2一抗后4℃冰箱孵育过夜→洗掉一抗；浸泡在PBS溶液缸中摇床上8min/次，清洗3次→孵育二抗；按1∶100稀释荧光二抗后室温避光孵育2h→洗掉二抗;浸泡在PBS溶液缸中摇床上8min/次清洗3次→甘油封片→正置荧光显微镜下观察结果。

5蛋白提取

(1)各个时间点，麻醉大鼠后迅速处死，置于冰上快速切取以损伤节段为中心约1cm长胸段脊髓组织，放于EP管并立刻置入-80℃深低温冰箱保存备用； (2)待所有时间点脊髓标本收集完整后，从-80℃冰箱取出放置于冰上，并将苯甲基磺酰氟(PMSF)加入到放射免疫分析(RIPA)裂解液中，使裂解液中PMSF浓度为1mM； (3)按每20mg组织加入200μL裂解液的比例加入适量含PMSF的RIPA裂解液，在冰上使用玻璃匀浆器充分匀浆； (4)4℃离心机，12 000g离心15min取上清即为提取的蛋白溶液，用牛血清蛋白(BCA)试剂盒检测蛋白浓度； (5)加入适量5×上样缓冲液，使上样缓冲液最终浓度为1×，煮沸蛋白10min使蛋白变性，放入-20℃冰箱备用。

6Western Blotting检测

(1)将长短玻璃板洗净晾干，正确置于制胶架上； (2)灌胶：玻璃板对齐垂直固定于架子上，按前述配方配置10%的浓缩胶进行灌胶，至约2/3位置，然后上层加水封胶压平，室温约20min后在胶和水之间出现一条水平折线，说明分离胶已凝固；倒掉上层水并用滤纸吸净玻璃板间残留水滴，配置浓缩胶并填满玻璃板之间的剩余空间，水平插入10孔梳子； (3)加样：用微量加样器加样，根据测得的样本蛋白浓度，每孔加入100μg蛋白样品；(4)电泳：浓缩胶中稳流0mA，分离胶中稳压80U； (5)转膜：200mA稳流进行，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的转膜时间为50min左右，神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的转膜时间为80min左右，Mfn2的转膜时间为140min左右； (6)封闭：10%牛血清白蛋白(BSA)封闭液室温摇床上封闭1h； (7)孵一抗：用5%的BSA稀释一抗，其中Mfn2按1∶1000、GFAP按1∶1000、GAPDH按1∶3000的浓度稀释，4℃过夜； (8)孵二抗：1×混合配方缓冲盐(TBST)溶液以10min/次洗膜3次后，二抗按1∶3000浓度稀释，室温下孵育2h； (9)洗二抗：1×TBST溶液以8min/次洗3 次； (10)电化学发光(ECL)显色液试剂盒中A液和B液按1∶1混合配备，将配好的显色液滴在膜上5min 后，在Western Blotting曝光仪中观察实验结果。

7细胞免疫荧光染色

培养皿中的贴壁星形胶质细胞弃培养基，用PBS溶液清洗3次(5min/次)→冰甲醇室温固定15min后，PBS溶液清洗2次(8min/次)→封闭;山羊血清封闭液室温下封闭1h→孵育一抗，4℃过夜;Mfn2抗体按1∶200稀释；GFAP抗体按照1∶100稀释→PBS溶液水平摇床8min/次清洗3次→孵育二抗;滴加1∶100稀释的二抗后室温避光孵育2h；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔二抗1∶100；Cy3标记的山羊抗小鼠二抗1∶100→PBS清洗3次(8min/次)→甘油封片，正置荧光显微镜下观察结果。

8统计学处理

结果

1胸段脊髓组织免疫荧光检测

病理切片免疫荧光检测结果显示，sham组脊髓组织结构清晰，灰、白质边界清楚，对比明显，无明显空腔和出血。SCI组可见灰质结构破坏，特别是两背角之间可见大面积损伤灶，内部存在空洞，结构难辨别，边界不清晰，染色程度不一，甚至形成囊腔及胶质瘢痕(图1)。

2胸段脊髓组织中Mfn2表达变化

Western Blotting结果显示，与sham组相比，SCI组Mfn2的表达随时间延长逐渐降低；条带灰度值扫描结果显示，脊髓损伤后Mfn2表达随时间推移整体呈下降趋势，从第3天开始出现明显下降，并且差异有统计学意义(P<0.05，图2a)。免疫荧光检测显示，随着脊髓损伤时间的推移，Mfn2的表达逐渐降低(图2b)。

3GFAP表达变化

Western Blotting结果显示，与sham组相比，SCI组GFAP的表达变化随时间延长逐渐增加；条带灰度值扫描结果显示，脊髓损伤后GFAP表达随时间推移整体呈上升趋势，从第3天开始GFAP的表达明显增加，并且差异有统计学意义(P<0.05，图3a)。免疫荧光结果也观察到一致的结果(图3b)。

图1sham组与SCI组第7天脊髓组织免疫荧光(厚度20μm40×)

ab

图2a.不同时间点MFn2表达(Western Blotting)； b.不同时间点MFn2表达(免疫荧光)

ab

图3a.不同时间点GFAP表达(Western Blotting)； b.不同时间点GFAP表达(免疫荧光)

讨论

脊髓损伤后损伤部位AS细胞通过自分泌、旁分泌的细胞因子促进自身分裂增殖，形成胶质瘢痕，活化的星型胶质细胞(AS)是形成胶质瘢痕的最主要细胞成分。胶质瘢痕的形成是一把双刃剑，在SCI早期可隔离损伤刺激、调节炎症反应、维持局部内环境稳定，起保护性屏障作用，但是发展到脊髓损伤的晚期，AS大量增殖伴胞体肥大，导致细胞大量重叠，不但成为阻止轴突生长的物理屏障，而且其还分泌抑制轴突生长的化学成分。

脊髓损伤后晚期由于AS大量活化形成的胶质瘢痕是阻碍脊髓损伤修复的重要物理及生化屏障，因此寻找能够有效抑制AS过度活化和胶质瘢痕形成的手段，对促进脊髓损伤后轴突再生、最终达到脊髓损伤修复的目的至关重要。而对AS活化进行细胞周期调控是近来研究神经损伤修复的一个新的方向，已有研究表明白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和睫状神经营养因子(ciliary neurotropic factor,CNTF)可以刺激AS由静止态转为活化态，成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factors-2，FGF-2)、上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能够刺激活化的AS进入细胞周期[5]。Di-Giovanni等[6]在运用一种能对小分子细胞周期素依赖性蛋白激酶起抑制作用的抑制剂Flavopiridol后，胶质瘢痕的形成减少，且对正常生理状态下的AS细胞并无抑制作用。由此表明细胞周期的重新启动在AS的活化增殖过程中扮演着重要角色，倘若能够寻求有效地抑制AS细胞周期重启的手段，必定将能够为脊髓损伤修复提供新的治疗靶点。

Mfn2其功能除介导线粒体融合、参与细胞能量代谢和信号转导外，还能起调控细胞增殖和凋亡等众多作用。Mfn2编码产物可通过抑制ERK/MAPK的信号传导途径，使细胞周期停滞在G0/G1期，从而起抑制细胞增殖作用，已有许多研究发现Mfn2蛋白有抑制细胞过度增殖的效应。Guo等[7-9]分别在心血管、肿瘤及肾脏的研究中发现，各自研究疾病出现细胞异常增值时，内源性Mfn2表达减少，运用腺病毒载体导入外源性基因，使Mfn2表达增加后，原异常增殖的细胞增殖现象得到抑制，因此认为Mfn2过表达时能抑制细胞过度增殖。

GFAP又名胶质纤维酸性蛋白，是一种星形胶质细胞特异性蛋白质，其含量的变化可以反映星形胶质细胞数量或活化程度的改变，因此被选为本次实验检测指标。在离体培养的星形胶质细胞内检测到有Mfn2蛋白表达，这为研究Mfn2蛋白与脊髓损伤后星形胶质细胞胶质瘢痕的形成之间的关系提供了理论依据。本实验发现，脊髓损伤后星形胶质细胞的特异性标志物GFAP表达呈显著上升趋势，伤后第3天起与sham组相比上升幅度较大，与此相反，脊髓损伤后脊髓组织内Mfn2表达呈下降趋势，表明在脊髓损伤后出现内源性Mfn2 表达减少。通过上述现象，笔者认为脊髓中内源性Mfn2这种增殖抑制基因表达减少可能在脊髓损伤后AS过度活化过程中扮演重要角色。本实验证实了脊髓损伤后内源性Mfn2表达减少与星形胶质细胞过度活化之间的关系，为研究抑制胶质瘢痕形成促进脊髓损伤修复提供了新的靶点，但其具体作用机制还有待进一步研究。

参考文献：

[1] Morin-Richaud C,Feldblum S,Privat A.Astrocytes and oligodendrocytes reactions after a total section of the rat spinal cord[J].Brain Res,1998,783(1):85-101.

[2] Fitch MT,Doller C,Combs CK,et al.Cellular and molecular mechanisms of glial scarring and progressive cavitation: in vivo and in vitro analysis of inflammation-induced secondary injury after CNS trauma[J].J Neurosci,1999,19(19):8182-8198.

[3] Chen KH,Guo X,Ma D,et al.Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nat Cell Biol,2004,6(9):872-883.

[4] 熊春翔，宗少晖，曾高峰，等.大鼠Allen’s脊髓损伤模型的建立及评价[J].广西医科大学学报,2011,28(2):215-217.

[5] Albrecht PJ,Dahl JP,Stoltzfus OK,et al.Ciliary neurotrophic factor activates spinal cord astrocytes, stimulating their production and release of fibroblast growth factor-2, to increase motor neuron survival[J].Exp Neurol,2002,173(1):46-62.

[6] Di Giovanni S,Movsesyan V,Ahmed F,et al.Cell cycle inhibition provides neuroprotection and reduces glial proliferation and scar formation after traumatic brain injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(23):8333-8338.

[7] Guo X,Chen KH,Guo Y,et al.Mitofusin 2 triggers vascular smooth muscle cell apoptosis via mitochondrial death pathway[J].Circ Res,2007,101(11):1113-1122.

[8] Jin B,Fu G,Pan H,et al.Anti-tumour efficacy of mitofusin-2 in urinary bladder carcinoma[J].Med Oncol,2011,28(S1):S373-380.

[9] Wan-Xin T,Tian-Lei C,Ben W,et al.Effect of mitofusin 2 overexpression on the proliferation and apoptosis of high-glucose-induced rat glomerular mesangial cells[J].J Nephrol,2012,25(6):1023-1030.

(本文编辑： 黄小英)

The relationship between expression changes of Mfn2 and astrocyte activation after spinal cord injury

LIChang-li1,ZHENGLi1,JIANGMeng2,YICheng-la2,BAIXiang-jun2

(1.Department of Geriatrics,Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese & Western Medicine,Wuhan430015;2.Department of Traumatic Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between expression changes of Mfn2 and astrocyte activation after spinal cord injury(SCI) and analyze its significance,so as to provide a basis for the next research about overexpression of Mfn2 suppressing the astrocytes activation after SCI. MethodsThe rat models of SCI were built and the expression of Mfn2 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) was detected using the methods of immunofluorescence-staining and Western Blotting. Forty-eight adult male SD rats were randomly divided into two groups: sham group(n=24) and SCI group(n=24). Thoracic spinal cord injured model was built in animals of the SCI group according to the Allen’s method,but the animals of the sham group only received laminectomy. Animals were anesthetized and thoracic spinal cord tissues were taken at the days of 1,3,7 and 14 separately. Then histologic-immunofluorescence-staining was made to observe the morphology of the spinal cord and Western Blotting was made to detect the expression changes of GFAP and Mfn2 at various time points. ResultsThe immunofluorescence staining result showed that after SCI,the thoracic segment between dorsal horns of spinal cord grey matter was damaged and the structure was disordered and the boundary was not clear;the result of Western Blotting showed that after SCI,the expression of Mfn2 in the thoracic spinal cord was decreased from the first day,compared with the sham group;the Mfn2 expression of group of thoracic SCI was decreased entirely and obviously from the third day after operation,with significantly statistical difference(P<0.05);the expression of GFAP increased gradually with the development of injury,and the difference was statistically significant from the third day after the operation(P<0.05). ConclusionAfter SCI,the expression of GFAP which is the specific marker of astrocytes is increased. At the same time,the products of Mfn2 which is proved to be a hyperplasia suppressor gene is decreased. So there is an inversed relationship between the expression of Mfn2 and the activation and proliferation of astrocytes after SCI.

【Key words】spinal cord injury; chondriosome; astrocyte; protein; rats

文章编号：1009-4237(2016)03-0153-05

通讯作者：郑莉,E-mail:1078616252@qq.com

【中图分类号】R 651.2

【文献标识码】A【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.03.008

(收稿日期：2015-07-17； 修回日期： 2016-01-05)

附属同济医院创伤外科(蒋猛，易成腊，白祥军)