重组人TNFR-Fc基因水稻种子特异表达载体构建

段永波， 赵丰兰， 姚　磊， 滕井通， 盛　玮， 张爱民， 薛建平

( 淮北师范大学 生命科学学院/资源植物生物学安徽省重点实验室， 安徽 淮北 235000 )



重组人TNFR-Fc基因水稻种子特异表达载体构建

段永波， 赵丰兰， 姚磊， 滕井通， 盛玮， 张爱民， 薛建平*

( 淮北师范大学 生命科学学院/资源植物生物学安徽省重点实验室， 安徽 淮北 235000 )

摘要：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)在治疗系统性自身免疫疾病中有很好的功效。目前TNFR-Fc主要通过动物细胞系生产，高昂的成本限制了其大规模应用。使用水稻种子作为生物反应器有望大幅度降低TNFR-Fc的生产成本，提供优质足量的目标产品。为使TNFR-Fc基因能够在水稻中高效表达，该研究拟构建经水稻偏好密码优化的TNFR-Fc基因的种子特异表达载体。通过对水稻和人全基因组密码子使用偏好性进行比较分析并按照水稻最优密码对TNFR-Fc氨基酸序列进行逐一优化，命名为RfTNFR-Fc，通过全基因合成法制备该基因片段；同时采用PCR法扩增水稻种子特异表达启动子Glu-4，构建种子特异表达启动子驱动的RfTNFR-Fc基因表达载体。结果表明：水稻与人多数氨基酸中密码子使用偏好性较为一致，但在L、S、P、R这4种氨基酸的密码子使用偏好性差异较大，优化时对这些密码子进行逐一替换，优化后30.8%的氨基酸密码子发生了变化；PCR扩增获得种子特异启动子，并连接至pCAMBIA1381载体，同时将全基因合成法制备的RfTNFR-Fc基因连入该载体，PCR、双酶切验证及测序分析表明载体成功构建。该研究构建的RfTNFR-Fc基因种子特异表达载体，为在水稻种子中大规模生产TNFR-Fc奠定了基础。

关键词：水稻， 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)， 偏好密码优化， 种子特异表达， 载体构建

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)由467个氨基酸组成，对系统性自身免疫疾病，如类风湿关节炎、银屑病、强直性脊柱炎等都有很好的治疗效果(Rothe et al，1992；Stübgen，2011)。临床上极低剂量的TNFR-Fc蛋白(推荐成人使用剂量为每次注射25 mg)即可发挥功能。目前TNFR-Fc商业化生产主要依靠中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系(Xu et al，2011)，高昂的反应器维持费用及难以迅速扩大的生产规模使得该药用蛋白价格居高不下，急需降低TNFR-Fc生产成本以满足巨大的市场需求。植物表达体系生产成本低、容易规模化、产品质量高、安全性高(无动物病毒污染)等优点(Horn，2012；Stoger et al，2014)，具有很好的应用前景。

在诸多植物表达体系中，水稻种子是生产药用蛋白最具潜力的系统之一(Ou et al，2014)。水稻遗传转化技术已较为成熟(Mishimura et al，2007；Duan et al，2012)，为药用蛋白生产的“工厂”(转基因植株)的建立奠定了基础。水稻种子已被用于特异表达白细胞介素(Fujiwara et al，2010)、蜱螨过敏原(Suzuki et al，2011)和人溶酶体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(Patti et al，2012)等多种外源重组蛋白，表达量介于7.0～60.0 mg·g-1之间。采用水稻种子特异的强启动子Gt13a及其信号肽驱动人血清白蛋白基因表达，目标蛋白表达量达到2.75 mg·g-1糙米，且理化结构及生化特征与人血浆中提取的蛋白基本一致(He et al，2011)。该体系能大幅度提高人碱性成纤维细胞生长因子表达水平(An et al，2013)。因此，使用种子特异表达强启动子，使蛋白在特定时间和空间内表达，减少不必要的能量和原料消耗，有利于提高目标蛋白表达水平。目前，尚未发现有关在植物中表达TNFR-Fc的报道。本研究按照水稻遗传密码使用偏好性对TNFR-Fc基因进行设计和优化，构建水稻谷蛋白启动子驱动的种子特异表达载体，以期为发展水稻种子TNFR-Fc表达系统及其大规模生产奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料

供试的水稻材料日本晴种子为安徽省农业科学院水稻研究所李浩博士惠赠。植物表达载体pCAMBIA1381及大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α为资源植物生物学安徽省重点实验室保存。

PCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；限制性内切酶BamHI、HindⅢ、T4DNA连接酶均购自New England BioLabs(NEB)公司；DNA凝胶回收试剂盒购自AxyGen Biosciences公司；pMD18-T vector购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司；卡那霉素和氨苄青霉素钠盐等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。引物和基因合成以及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻与人遗传密码使用偏好性分析水稻(Oryzasativa)和人(Homosapiens)的密码子信息从密码子使用数据库www.kazusa.or.jp/codon获得。水稻包括34、132、283个密码子，编码92188 CDS(coding DNA sequences)；而人类使用40 662 582个密码子，编码93487 CDS。对水稻和人的编码各氨基酸的同义密码子使用频率进行调查比较，使用频率最高的密码子认定为偏好密码子。

1.2.2RfTNFR-Fc基因设计与合成重组蛋白TNFR-Fc由人肿瘤坏死因子可溶性受体的细胞外配体结合部分(TNFR，235 AA)与人类IgG1 Fc段(232 AA)融合而成。基于水稻密码子使用偏好性，根据TNFR-Fc氨基酸序列设计重组TNFR-Fc基因(RfTNFR-Fc)，长度1 407 bp。同时在其5′端添加醇溶蛋白信号肽序列(Os07g0206400)，人工合成后克隆至pUC57载体，酶切位点为BamHI/NheI，获得BamHI-sp-SpeI- TNFR-Fc-NheI。

1.2.3 水稻种子特异表达启动子克隆采用谷蛋白GluB4基因(AK107238)启动子特异引物(Patti et al，2012)，以日本晴基因组DNA为模板进行PCR扩增。引物序列为GluB4F-aagcttcggaattctacagggttcctt gcgtgaaga(下划线表示HindIII酶切位点)和 GluB4R-ggatcccgggatccagctatttgaggatgttattgg(下划线表示BamHI酶切位点)。PCR扩增体系如下：5 μL 10 × PCR buffer，4 μL 25 mmol·L-1MgCl2，4 μL 2.0 mmol·L-1dNTPs，2 μL 10 μmol·L-1引物(上、下游引物各1 μL)，0.4 μL 5 U·μL-1TaqDNA聚合酶，100 ng DNA 模板，ddH2O至50 μL。PCR 扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s进行30个循环；72 ℃延伸 7 min。PCR产物连接至pMD18-T vector，挑取PCR阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4RfTNFR-Fc种子特异表达载体构建提取含有BamHI-sp-SpeI-TNFR-Fc-NheI片段的pUC57质粒进行BamHI/NheI双酶切，回收1 482 bp片段；同时采用BamHI/NheI对pCAMBIA1391质粒进行线性化处理。用TaKaRa T4DNA连接酶将目标片段与线性化载体进行连接重组，提取阳性菌落质粒进行PCR扩增和BamHI/NheI双酶切鉴定，鉴定正确的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2结果与分析

2.1 水稻与人密码子使用偏好性比较

对水稻与人全基因组密码子使用偏好性分析表明(图1)，水稻CDSs中GC含量为55.3%，比人使用GC的频率(52.3%)高出3.0%。这2个物种在密码子1、2、3位使用GC的频率也有差异。水稻在1、2、3位使用GC频率为58.2%、46.0%和61.6，分别比人类高2.5%、3.5%和3.0%。

图 1　水稻与人全基因组编码区及各密码子位GC含量比较Fig. 1　Comparison of GC contents in genetic codons and various positions between rice and human

这2个物种全基因组范围内的密码子使用频率统计情况见表1。对各氨基酸的简并密码进行分析，各氨基酸使用频率最高的密码子作为偏好密码子。水稻偏好密码子：TTC (F)、CTC(L)、TCC(S)、TAC(Y)、TGC(C)、TGG(W)、CCG(P)、CAC(H)、CAG(Q)、CGC(R)、ATC(I)、ATG(M)、ACC(T)、AAC(N)、AAG(K)、GTG(V)、GCC(A)、GAC(D)、GAG(E)、GGC(G)、TGA(stop)；人类偏好密码子：TTC (F)、CTG(L)、AGC(S)、TAC(Y)、TGC(C)、TGG(W)、CCC(P)、CAC(H)、CAG(Q)、AGA(R)、ATC(I)、ATG(M)、ACC(T)、AAC(N)、AAG(K)、GTG(V)、GCC(A)、GAC(D)、GAG(E)、GGC(G)、TGA(stop)。分析表明，水稻及人类编码F、Y、C、W、H、Q、I、M、T、N、K、V、A、D、E、G及终止密码的偏好密码子相同。L在水稻的偏好密码为CTG(使用频率25.8‰)，而人类偏好密码为CTC(39.6‰)，比水稻(21.0‰)中高出18.6‰；S在水稻的偏好密码为TCC(使用频率16.3‰)而人类偏好密码为AGC(19.5‰)；P在水稻的偏好密码为CCG(使用频率18.0‰)，该密码子在人类中使用频率仅为6.9‰，而人类偏好密码为CCC(19.8‰)；R在水稻的偏好密码为CGC(使用频率16.1‰)，而人类偏好密码为AGA(12.2‰)。如直接以人源的原始核苷酸序列在水稻中进行基因表达，可能导致表达量极低。而因此有必要按照水稻密码子偏好性对TNFR-Fc进行逐一优化，以提高其在水稻中的表达水平。

2.2 RfTNFR-Fc设计与合成

TNFR-Fc氨基酸序列包括235 aa的TNFR和232 aa的Ig gamma-1 chain C 片段，采用水稻偏好密码子对整个氨基酸序列进行逐一编码，获得1 407 bp长的基因片段RfTNFR-Fc(图2)。共有144个氨基酸的密码子发生改变，占全氨基酸序列的30.8%。

表 1　水稻与人全基因组各密码子使用频率比较

注： 使用频率指每1 000碱基对中该密码子出现的频率，下划线黑体表示最优密码子。

Note: Use frequency is defined as the frequency of specific codons in every 1 000 base pairs, and the underlined bold data represent preferred codons.

图 2　RfTNFR-Fc基因序列　小写字母表示醇溶蛋白信号肽序列； 下划线部分表示酶切位点。Fig. 2　Sequence of synthetic RfTNFR-Fc　Lowercase letters represent signal peptide of prolamin, and the underlined ones are the endonuclease recognition sites.

在RfTNFR-Fc 5′端前加上醇溶蛋白信号肽序列和相应酶切位点，获1 482 bp片段。全基因人工合成后导入克隆载体pTC57，获得pUC57-RfTNFR-Fc。

2.3 种子特异启动子GluB-4克隆

以GluB-4特异引物进行PCR扩增，获得1 447 bp片段(图3：a)。回收该片段进行HindIII/BamHI双酶切，将酶切产物与线性化处理的pCAMBIA1381载体进行重组。提取阳性菌落质粒进行酶切验证，获得约1 500 bp特异条带(图3：b)，说明GluB-4启动子片段成功连入表达载体，获得种子特异表达载体pCAMBIA-Glu。

2.4 RfTNFR-Fc种子特异表达载体构建与验证

用BamHI/NheI同时双酶切处理pUC57- RfTNFR-Fc和载体pCAMBIA1381，分别回收小片段和大片段进行重组(用RfTNFR-Fc替换Gus)。对重组质粒进行BamHI/NheI双酶切验证表明，RfTNFR-Fc已成功连接至pCAMBIA Glu载体(图4)，获得pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc。测序结果验证表明种子特异启动子驱动的水稻偏好密码子优化的TNFR-Fc植物表达载体pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc已成功构建。

图 3　GluB-4启动子克隆与表达载体pCAMBIA 1381构建　a. GluB-4启动子PCR扩增结果； b. pCAMBIA-Glu载体双酶切检测结果； M. 标准分子量 DL2000； 1. 产物。Fig. 3　Cloning of GluB-4 promoter and ligation into expression vector pCAMBIA 1381　a. PCR product of GluB-4 promoter; b. Identification of pCAMBIA-Glu by double enzyme digestion； M. DNA marker DL2 000; 1. Product.

图 4　 pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc 酶切验证　M. λ Hind Ⅲ; 1, 2. 不同重组子克隆。Fig. 4　Identification of pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc via double enzyme digestion.　M. λ Hind Ⅲ; 1, 2. Represent different clones of recombinants.

3讨论与结论

采用异源表达方式生产药用重组蛋白已成为药物生产从化学合成到生物合成转变的必要途径，对于免疫自缺陷类疾病更是如此。在异源表达过程中，宿主、分泌途径、启动子特性和密码子使用偏好性等因素都可能导致目标蛋白表达水平降低(蔡海莺等，2013)。相关研究中必须考虑上述因素，进而提高目标蛋白表达量。目前有关基因密码子优化的研究多集中在抗病虫害基因工程领域，如将苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因Cry1进行作物偏好密码子优化(周宗梁等，2012；Song et al，2014)，以提高植物中的表达水平。此类研究通常将微生物来源的基因优化后在高等生物中表达，常需根据密码子偏好性提高G+C含量，消除attta(Nicolai et al，2000)、A+T富含区(Goodall & Filipowicz，1989)及polyA(Dean et al，1986)等易导致表达量低的因素。

通过对水稻与人全基因组密码子使用偏好性分析，发现水稻CDSs中GC含量为55.3%，而人使用GC的频率为52.3%；2个物种多数氨基酸密码子使用情况较为一致，但L、S、P、R这4种氨基酸差异极大。推测高等生物间异源表达时基因优化的关键不在于消除A+T造成的序列不稳定，极可能是少数氨基酸差异密码子的优化。本研究以人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)为对象，选择水稻种子特异表达系统，按照水稻密码子使用偏好进行优化，构建植物表达载体。PCR法获得种子特异启动子并克隆至植物表达载体pCAMBIA1381。全基因组范围分析水稻与人密码子使用偏好性并进行优化，全基因合成时在RfTNFR-Fc 5′端加入醇溶蛋白信号肽序列指导目标蛋白的分泌。将人工合成的RfTNFR-Fc连入pCAMBIA-Glu，酶切及测序验证表达载体成功构建，获得水稻种子特异表达载体pCAMBIA-Glu- RfTNFR-Fc。本研究为以水稻种子为“工厂”生产TNFR-Fc及其理化结构和生物活性评价奠定了基础。

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(Continueonpage581)(Continuefrompage594)

Construction of rice seed-specific expression vector expressing rice-preferred codon-optimizedTNFR-Fcgene

DUAN Yong-Bo, ZHAO Feng-Lan, YAO Lei, TENG Jing-Tong, SHENG Wei, ZHANG Ai-Min, XUE Jian-Ping*

(KeyLaboratoryofResourcePlantBiologyofAnhuiProvince,CollegeofLifeSciences,HuaibeiNormalUniversity, Huaibei 235000, China )

Abstract:Recombinant human α receptor antibody- protein of tumor necorsis factor Type II fusion protein (TNFR-Fc) is an effective mean to treat the systemic autoimmune diseases. This protein is currently produced via animal cell lines. The high cost of bioreactor maintenance brings an economic burden for common patients, which largely limits the application of TNFR-Fc. Rice seed offers a good expression system for production of recombinant proteins. To efficiently express TNFR-Fc in rice seed, we constructed seed-specific expression vector of rice-preferred codon optimized TNFR-Fc (RfTNFR-Fc), by analyzing the whole genomic difference in codon preference and replacing bases with rice-preferred codons. Rice seed specific promoter Glu-4 was amplified via PCR and ligated into pCAMBIA 1381, followed by the ligation with full length synthetic RfTNFR-Fc. The construct was identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The preferred codons of L, S, P and R differed between rice and human, though most of the amino acids shared the same preferred codons. In the optimized RfTNFR-Fc, 30.8% of the amino acids changed compared with the original version. PCR, double enzyme digestion and sequencing identified that pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc was successfully constructed. This study lays foundation for the expression of TNFR-Fc in rice seed, further facilitating its commercial production.

Key words:Oryza sativa, recombinant human α receptor antibody-protein of tumor necorsis factor type II fusion protein (TNFR-Fc), preferred codon optimization, seed-specific expression, vector construction

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201509024

收稿日期:2015-09-26修回日期： 2015-12-29

基金项目：国家自然科学基金(31501368, 81573518)；安徽省自然科学基金(1408085MC58, 1608085MC52)；安徽省教育厅省级高校自然科学基金重点项目和重大项目(KJ2014A226, KJ2015ZD35)[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31501368, 81573518), Natural Science Foundation of Anhui Province, China (1408085MC58, 1608085MC52); Key Project of Natural Science Research of Colleges and Universities in Anhui Province, China (KJ2014A226, KJ2015ZD35)]。

作者简介：段永波(1981-)，男，贵州贵阳人，博士，讲师，主要从事植物生物技术研究，(E-mail)yboduan@163.com。*通讯作者： 薛建平，博士，教授，主要从事药用植物生物技术研究，(E-mail)xuejp@163.com。

中图分类号：Q943.2, Q78， S18

文献标识码：A

文章编号：1000-3142(2016)05-0589-06

段永波，赵丰兰，姚磊，等. 重组人TNFR-Fc基因水稻种子特异表达载体构建 [J]. 广西植物， 2016， 36(5)：589-594

DUAN YB, ZHAO FL, YAO L，et al. Construction of rice seed-specific expression vector expressing rice-preferred codon-optimizedTNFR-Fcgene[J]. Guihaia， 2016， 36(5)：589-594