不同碳源和氮源对4种深色有隔内生真菌生长的影响

宋瑛瑛，黄　丽，唐　明

(西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 林学院，陕西 杨凌 712100)



不同碳源和氮源对4种深色有隔内生真菌生长的影响

宋瑛瑛a，黄丽a，唐明b

(西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 林学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 明确不同碳源及氮源对4种深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes，DSE)生长的影响,确定4种DSE生长的最适碳源和氮源，为深色有隔内生真菌的研究和应用奠定基础。【方法】 以沙门外瓶柄霉(Exophiala salmonis)、甘瓶霉(Phialophora mustea)、菊异茎点霉(Paraphoma chrysanthemicola)和枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)4种深色有隔内生真菌为材料，在固体和液体条件下培养，研究不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉和山梨醇)和氮源(磷酸氢二铵、草酸铵、硫酸铵、氯化铵、尿素、硝酸铵、硝酸钠、酸水解酪蛋白、胰蛋白胨和蛋白胨)对其菌丝平均生长速度和菌丝干质量的影响。【结果】 固体培养条件下，沙门外瓶柄霉、甘瓶霉和菊异茎点霉的最佳碳源均是葡萄糖，枝状枝孢菌的最佳碳源是乳糖；沙门外瓶柄霉、甘瓶霉和枝状枝孢菌的最佳氮源均是硝酸钠，菊异茎点霉的最佳氮源是胰蛋白胨。液体培养条件下，甘瓶霉、菊异茎点霉和枝状枝孢菌的最佳碳源均是可溶性淀粉，沙门外瓶柄霉的最佳碳源是葡萄糖；沙门外瓶柄霉、甘瓶霉、菊异茎点霉和枝状枝孢菌的最佳氮源分别是磷酸氢二铵、草酸铵、蛋白胨和硝酸铵。【结论】 初步确定了4种深色有隔内生真菌生长的最佳碳源和氮源。

[关键词]深色有隔内生真菌；碳源；氮源

深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes，DSE)指一类能定殖于植物根内，不引起植物明显病理学特征，不产孢或产无性孢子的一类小型真菌，属于子囊菌或半知菌[1-2]。DSE的宿主专一性不强，广泛分布于干旱、重金属污染等逆境生态系统中，发挥着类似菌根真菌的生态学功能[3]。研究表明，DSE可促进植物养分吸收[4-5]，增强植物的抗旱性[3]、抗病性[6]和对重金属的抗性[7-8]，在生态系统中发挥着重要作用。

相对于不可体外培养的丛枝菌根真菌，DSE可以在体外纯培养。因此，深入了解DSE体外纯培养的培养条件并对其进行优化尤为重要，尽管目前对DSE已有较多研究报道，但有关其纯培养营养条件的研究很少。本研究以分离自陕西凤县铅锌矿区的对铅具有较高耐性的4种DSE[9]为试验材料，研究了不同碳源和氮源对其生长的影响，以筛选其适宜的碳源和氮源，初步了解DSE的生物学特性，为DSE的研究和应用提供依据。

1材料与方法

1.1供试菌种

供试DSE菌种为沙门外瓶柄霉(Exophialasalmonis)、甘瓶霉(Phialophoramustea)、菊异茎点霉(Paraphomachrysanthemicola)和枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)，均分离自陕西凤县铅锌矿区植物沙打旺(Astragalusadsurgens)根部，保存于西北农林科技大学林学院微生物实验室。将保存的菌种接种于PDA平板培养基上，25 ℃暗培养10 d后用打孔器(直径5 mm)在菌落边缘打取菌饼，用于固体和液体培养接种。

1.2不同碳源对DSE生长的影响

固体培养：以改良MMN固体培养基[10]为基础培养基，用等量的蔗糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、乳糖、可溶性淀粉和山梨醇代替其中的葡萄糖(对照)，得到不同碳源培养基。将4种真菌分别取1个菌饼接种于培养基中央，25 ℃暗培养25 d，测量菌落直径，计算菌丝平均生长速度；同时参照李芳等[11]的方法收获菌丝，80 ℃烘干至恒质量后称量菌丝干质量(生物量)。每处理做4个重复。

液体培养：去除MMN固体培养基中的琼脂进行液体培养。于250 mL三角瓶中装入100 mL液体MMN培养基，每瓶接种2个菌饼，25 ℃、120 r/min 摇床培养7 d，参照宿红艳等[12]的方法过滤收集菌丝并用自来水冲洗3次，80 ℃烘干至恒质量后称量菌丝干质量(生物量)。每处理做4个重复。

1.3不同氮源对DSE生长的影响

用等量的无机氮(草酸铵、硫酸铵、氯化铵、尿素、硝酸铵、硝酸钠)和有机氮(酸水解酪蛋白、胰蛋白胨和蛋白胨)代替MMN培养基中的磷酸氢二铵(对照)，得到不同氮源培养基。按照1.2的方法进行DSE固体培养和液体培养，测定菌丝平均生长速度和生物量。每处理做4个重复。

1.4数据处理

采用Excel 2007和SPSS 20.0软件进行数据统计分析，使用Sigmaplot 10.0绘图。所有数据为4次重复的平均值。

2结果与分析

2.1不同碳源对4种DSE生长的影响

4种DSE均能利用供试的8种碳源，说明它们可利用的碳源范围较广。

2.1.1对沙门外瓶柄霉生长的影响由图1可知，固体培养条件下，以乳糖为碳源时沙门外瓶柄霉平均生长速度较快，其次是可溶性淀粉，分别比对照(葡萄糖)显著提高了13.2%和9.9%(P<0.05)；以葡萄糖为碳源时沙门外瓶柄霉生物量较大，其次是麦芽糖，二者与其他碳源差异显著(P<0.05)。由表1可知，液体培养条件下，以葡萄糖和麦芽糖为碳源时沙门外瓶柄霉的生物量较大，且二者没有显著差异，但明显优于其他碳源。据此确定，固体和液体培养时沙门外瓶柄霉适宜的碳源均是葡萄糖和麦芽糖。

2.1.2对甘瓶霉生长的影响由图1可知，固体培养条件下，以可溶性淀粉为碳源时甘瓶霉平均生长速度最快，其次是乳糖，两者比对照(葡萄糖)分别显著提高了22.3%和13.7%(P<0.05)；以葡萄糖和麦芽糖为碳源时甘瓶霉生物量较大，其次是乳糖和果糖，与其他碳源差异显著(P<0.05)。由表1可知，液体培养条件下，以可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖为碳源时甘瓶霉生物量较大，其次是麦芽糖和甘露醇，与其他碳源差异显著(P<0.05)。据此确定，固体培养时，甘瓶霉生长适宜的碳源是葡萄糖和麦芽糖，液体培养时适宜的碳源是可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖。

2.1.3对菊异茎点霉生长的影响由图1知，固体培养条件下，以葡萄糖和甘露醇为碳源时菊异茎点霉平均生长速度较快，其次是乳糖，三者与其他碳源差异显著(P<0.05)；以葡萄糖和乳糖为碳源时菊异茎点霉生物量较大，其次是可溶性淀粉。由表1可知，液体培养条件下，以可溶性淀粉为碳源时菊异茎点霉生物量较大且比对照显著提高89.7%(P<0.05)，其次是葡萄糖和蔗糖。所以菊异茎点霉固体培养时适宜的碳源是葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉，液体培养时适宜的碳源是可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖。

2.1.4对枝状枝孢菌生长的影响由图1知，固体培养条件下以可溶性淀粉为碳源时枝状枝孢菌平均生长速度较快，比对照显著提高13.6%(P<0.05)，其次是乳糖和葡萄糖；以乳糖、山梨醇、葡萄糖和甘露醇为碳源时枝状枝孢菌生物量较大且与其他碳源差异显著(P<0.05)。由表1可知，液体培养条件下，以可溶性淀粉为碳源时枝状枝孢菌生物量较大，其次是乳糖，分别比对照显著提高41.1%和18.3%(P<0.05)。所以枝状枝孢菌固体培养时适宜的碳源是乳糖、山梨醇、葡萄糖和甘露醇，液体培养时适宜的碳源是可溶性淀粉和乳糖。

图 1　固体培养时不同碳源对4种DSE生长的影响

注：同列数据后标不同小写字母表示各碳源处理间差异显著(P<0.05)，表2同。

Note:Different letters in each column indicate significant difference (P<0.05).The same for Table 2.

2.2不同氮源对4种DSE生长的影响

4种DSE都能利用供试的10种氮源，说明它们可利用的氮源范围比较广。10种氮源对4种DSE生长的影响结果见图2和表2。

图 2　固体培养时不同氮源对4种DSE生长的影响

2.2.1对沙门外瓶柄霉生长的影响由图2知，固体培养条件下，以硝酸钠为氮源时沙门外瓶柄霉平均生长速度较快，其次是尿素和蛋白胨，三者分别比对照显著提高26.1%，13.0%和12.3%(P<0.05)；以硝酸钠为氮源时沙门外瓶柄霉生物量较大，其次是蛋白胨、尿素和胰蛋白胨，其分别比对照显著提高76.4%，59.1%，42.3%和41.2%(P<0.05)。由表2可知，液体培养条件下，以磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵和硝酸钠为氮源时沙门外瓶柄霉生物量较大且与其他氮源差异显著(P<0.05)，说明沙门外瓶柄霉对它们的利用较其他氮源好。所以沙门外瓶柄霉固体培养时适宜的氮源是硝酸钠、蛋白胨、尿素和胰蛋白胨，液体培养时适宜的氮源是磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵和硝酸钠。

2.2.2对甘瓶霉生长的影响由图2知，固体培养条件下，以硝酸钠为氮源时甘瓶霉平均生长速度较快，其次是蛋白胨，分别比对照显著提高61.3%和41.9%(P<0.05)；以硝酸钠为氮源时甘瓶霉生物量较大，其次是硝酸铵、胰蛋白胨和蛋白胨，分别比对照显著提高76.9%，65.4%，60.7%和56.3%(P<0.05)。由表2可知，液体培养条件下，以草酸铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵和氯化铵为氮源时甘瓶霉生物量显著高于其他氮源，分别比对照显著提高118.8%，109.7%，96.6%，93.4%和83.9%(P<0.05)。所以固体培养时甘瓶霉适宜的氮源是硝酸钠、硝酸铵、胰蛋白胨和蛋白胨，液体培养时适宜的氮源是草酸铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵和氯化铵。

2.2.3对菊异茎点霉生长的影响由图2知，固体培养条件下，以硝酸钠为氮源时菊异茎点霉平均生长速度较快，其次是胰蛋白胨和蛋白胨，分别比对照显著提高124.3%，77.1%和74.3%(P<0.05)；以胰蛋白胨为氮源时菊异茎点霉生物量较大，其次是蛋白胨，分别比对照显著提高86.0%和75.6%(P<0.05)。由表2可知，液体培养条件下，以蛋白胨和胰蛋白胨为氮源时菊异茎点霉生物量较大，分别比对照显著提高41.7%和24.1%(P<0.05)。所以菊异茎点霉固体和液体培养时适宜的氮源均是蛋白胨和胰蛋白胨。

2.2.4对枝状枝孢菌生长的影响由图2知，固体培养条件下，以硝酸钠为氮源时枝状枝孢菌平均生长速度较快，其次是胰蛋白胨和蛋白胨，分别比对照显著提高130.8%，117.9%和113.8%(P<0.05)；以硝酸钠为氮源时枝状枝孢菌生物量较大，其次是胰蛋白胨，分别比对照显著提高83.8%和60.6%(P<0.05)。由表2可知，液体培养条件下，以硝酸铵和硝酸钠为氮源时枝状枝孢菌生物量较大，分别比对照显著提高52.0%和50.3%(P<0.05)。所以枝状枝孢菌固体培养时适宜的氮源是硝酸钠和胰蛋白胨，液体培养时适宜的氮源是硝酸铵和硝酸钠。

3讨论

碳源和氮源是微生物生长繁殖、维持正常代谢必不可少的营养物质。碳源是微生物细胞骨架构建的主要物质和生命活动所需能源的提供者，而氮源则是微生物用来进行核酸、蛋白质、酶类以及含氮代谢产物合成的物质[13]。由于不同菌种产生的酶的种类、活性存在差异，导致其代谢能力不同，因此对营养物质的利用存在差异，如Xylariasp.Strain R006[14]和Paecilomycesjaponic[15]的最佳碳氮源均是葡萄糖与酵母浸膏，Lignosusrhinocerus[16]和Agaricusblazei[17]的最佳碳氮源分别是葡萄糖与硝酸钾、淀粉与酵母浸膏。本研究中4种DSE的最适碳氮源也不同。

氮源可分为有机氮和无机氮，本研究中菊异茎点霉对有机氮的利用相对无机氮好，与Ramesh等[14]对Xylariasp. Strain R006和Lee等[15]对Paecilomycesjaponic的研究结果一致，这可能是因为有机氮营养丰富且成分复杂，除含有氮素外还含有其他生长因子，更有利于微生物的生长。然而，沙门外瓶柄霉、甘瓶霉和枝状枝孢菌对无机氮的利用相对优于有机氮，这与Adour等[18]的研究结果一致，原因可能是无机氮比有机态氮更能促使微生物产生并积累一些代谢产物。

同一菌种在不同培养条件下的最佳碳氮源可能不同，如王美琴等[19]发现，在固体培养条件下，曲霉菌和白僵菌的最佳氮源分别是生物素和谷氨酸，而液体培养时它们的最佳氮源分别是天门冬氨酸和生物素。本研究结果表明，同种DSE菌种在不同培养条件下的最佳碳氮源不同。这可能由多种因素造成，如固体和液体培养基成分的最大不同就是琼脂，而琼脂作为最常用的微生物培养基固化剂，具有凝固性和稳定性，可与一些物质形成络合物，可能会改变固体培养基中碳源和氮源的存在形态，从而影响微生物对碳源和氮源的利用。此外，固体和液体培养条件下，微生物的代谢状态、水分、氧气、pH等都有所不同，这些也有可能使DSE对养分的利用情况发生变化。

4结论

不同DSE菌种在固体和液体培养条件下的最适碳源、氮源有异同。固体培养时，4种DSE都能很好地利用葡萄糖，沙门外瓶柄霉和甘瓶霉还能较好地利用麦芽糖，菊异茎点霉和枝状枝孢菌还能较好地利用乳糖；可溶性淀粉不适宜作为沙门外瓶柄霉的碳源，蔗糖和山梨醇不适宜作为甘瓶霉的碳源，果糖不适宜作为菊异茎点霉和枝状枝孢菌的碳源。沙门外瓶柄霉和甘瓶霉都能很好地利用硝酸钠，而菊异茎点霉对胰蛋白胨的利用最好，草酸铵、硫酸铵和氯化铵不适宜作为4种DSE的氮源。

液体培养时，沙门外瓶柄霉对葡萄糖的利用优于其他碳源，而甘瓶霉和菊异茎点霉都能很好地利用可溶性淀粉，乳糖和可溶性淀粉不适宜作沙门外瓶柄霉的碳源，山梨醇不适宜作甘瓶霉的碳源，果糖不适宜作菊异茎点霉和枝状枝孢菌的碳源；除菊异茎点霉对有机氮的利用优于无机氮外，其他3种DSE对无机氮源铵盐的利用比有机氮好，蛋白胨和胰蛋白胨不宜作沙门外瓶柄霉和甘瓶霉的氮源，硫酸铵、氯化铵、草酸铵、尿素不宜作菊异茎点霉和枝状枝孢菌的氮源。

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Effects of different carbon and nitrogen sources on growth of 4 dark septate endophytes

SONG Ying-yinga,HUANG Lia,TANG Mingb

(aCollegeofLifeSciences,bCollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The objective of this research was to understand the effect of different carbon and nitrogen sources on the growth of 4 dark septate endophytes,and find the optimum carbon and nitrogen sources.The results will provide basis for further study and application of dark septate endophytes.【Method】 Exophiala salmonis,Phialophora mustea,Paraphoma chrysanthemicola and Cladosporium cladosporioides were cultured in both solid and liquid medium to study the effects of different carbon (glucose,sucrose,maltose,mannitol,fructose,lactose,soluble starch,and sorbitol) and nitrogen (diammonium phosphate,ammonium oxalate,ammonium sulfate,ammonium chloride,urea,ammonium nitrate,sodium nitrate,acid hydrolyzed casein,tryptone,and peptone) sources on average growth rate and biomass.【Result】 Under solid culture condition,the optimum carbon source was glucose for all endophytes except C.cladosporioides,which showed the highest growth on lactose.The optimum nitrogen source of P.chrysanthemicola was tryptone,while the optimum nitrogen source of all others was sodium nitrate.Under submerged culture condition,the optimum carbon source of E.salmonis was glucose,while the optimum carbon source of all others was soluble starch.The optimum nitrogen source of E.salmonis,P.mustea,P.chrysanthemicola and C.cladosporioides was diammonium phosphate,ammonium oxalate,peptone,and ammonium nitrate,respectively.【Conclusion】 The nutritional cultivating conditions of 4 dark septate endophytes were determined.

Key words:dark septate endophytes;carbon source;nitrogen source

DOI：网络出版时间:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.025

[收稿日期]2014-07-16

[基金项目]林业公益性行业科研专项(201404217)；国家自然科学基金项目(31170567，31270639)；长江学者和创新团队项目(IRT1035)

[作者简介]宋瑛瑛(1988-)，女，甘肃天水人，在读硕士，主要从事微生物研究。E-mail：songyingying1988@126.com[通信作者]唐明(1962-)，女，安徽涡阳人，教授，主要从事微生物学和森林保护学研究。E-mail：tangmingyl@163.com

[中图分类号]Q938.1

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)03-0181-07