ERK抑制剂对1型糖尿病模型小鼠血管内损伤后内膜增生的抑制作用

王启章，陈茂刚，徐格林，刘新峰

1.南方医科大学南京临床学院/南京军区南京总医院(南京 210002)；2.广州医科大学附属深圳沙井医院



ERK抑制剂对1型糖尿病模型小鼠血管内损伤后内膜增生的抑制作用

王启章1，2，陈茂刚1，徐格林1，刘新峰1

1.南方医科大学南京临床学院/南京军区南京总医院(南京 210002)；2.广州医科大学附属深圳沙井医院

摘要：目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD98059对1型糖尿病模型血管内损伤后内膜增生的抑制作用。方法将实验动物分为3组，假手术组，1型糖尿病模型血管内损伤组，PD98059干预组。各组小鼠于颈动脉损伤后第28天处死并取右颈总动脉，检测颈动脉管腔面积、内膜面积、中膜面积及内膜/中膜面积比(I/M)。免疫组化检测内膜抗磷酸压ERK(p-ERK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平。结果与假手术组相比，1型糖尿病模型血管内损伤组术后28 d，管腔面积明显缩小，内膜面积、中膜面积及I/M明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，颈动脉血管内膜p-ERK及MMP-9水平也明显增强(P<0.01)。PD98059干预组术后28 d，与1型糖尿病模型血管内损伤组相比，管腔面积明显增加，内膜面积、中膜面积及I/M明显降低(P<0.01)，颈动脉内膜MMP-9表达明显减低，血脂及血糖水平无统计学意义。结论ERK抑制剂可能通过抑制MMP-9减轻1型糖尿病高胆固醇饮食模型颈动脉血管内损伤后内膜增生。

关键词：糖尿病；细胞外信号调节激酶；基质金属蛋白酶-9；血管内损伤；内膜增生；小鼠

颈动脉内膜剥脱及颈动脉支架术后内膜增生影响病人的远期预后，糖尿病病人发生率更高。关于颈动脉血管内损伤后内膜增生的确切机制没有统一结论，因而针对内膜增生原因行相应的靶向性干预治疗成为难点。细胞外信号调节激酶(ERK)是一种丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，在内膜增生过程中发挥重要作用[1]。本研究利用1型糖尿病内膜增生模型，探讨 ERK抑制剂对尿病高脂饮食小鼠血管内损伤后内膜增生的抑制作用，并探讨颈动脉损伤后内膜增生的可能机制。

1材料与方法

1.1材料本实验动物均为C57BL/6品系小鼠，周龄为8周。清洁级雄性INS2AKITA小鼠(突变型)12只及同窝出生的野生型C57BL/6雄性小鼠6只，由南京大学模式动物研究所提供，许可证号：SCXK(苏)2010-0001。羊抗兔二抗购自美国CST公司。PD98059(ERK特异性抑制剂)购自美国Tocris Bioscience公司。免疫组织化学SP试剂盒购自福州迈新生物科技有限公司。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)购自美国Abcam公司。高胆固醇饲料购自江苏协同医药生物工程有限公司，饲料配方为： 基础饲料87.5%；胆固醇2%；猪油10%；胆酸钠0.5%。

1.2实验动物与分组以INS2AKITA小鼠(是近年来发现的基因突变型1型糖尿病模型)为实验动物模型。小鼠分为3组，每组6只，周龄均为8周。第1组为假手术组：C57BL/6野生型雄性小鼠，普通饲料饮食，喂养8周后行分离右侧颈总动脉，分离结束后缝合皮肤。第2组为糖尿病鼠颈动脉损伤组：INS2AKITA雄性小鼠，高胆固醇饲料饮食，喂养8周后行右侧颈动脉血管内损伤；损伤开始每日腹腔注射二甲基亚砜(DMSO) 30 μL，直至处死。第3组为PD98059干预组：INS2AKITA雄性小鼠，高胆固醇饲料饮食，喂养8周后行右侧颈动脉血管内损伤；损伤开始每日腹腔注射PD98059 30 mg/kg，直至处死。PD98059均用0.1%DMSO溶解。所有小鼠自由饮食水，单笼饲养，室温20 ℃～25 ℃。均按分组条件喂养8周后，清晨麻醉处死前采血2 mL。麻醉处死后，立即取双侧颈总动脉，左侧颈总动脉放入4%多聚甲醛固定；右侧颈总动脉放入冻存管，-80℃保存。

1.3颈动脉血管内探针损伤过程戊巴比妥钠腹腔注射(0.5 mL/kg)麻醉后，仰位固定在手术台上。于无菌条件下逐层分离皮下组织，暴露气管。于气管左侧寻找右颈总动脉，将颈外动脉远心端用丝线结扎，用显微止血夹分别夹住颈总动脉近心段及颈内动脉；用显微剪将颈外动脉结扎近端剪一小切口；左手用显微镊将切口上端轻微拉起，右手将探针沿切口从颈外动脉管腔进入到颈总动脉近心端，将探针沿颈总动脉分别向上、下、左、右四个方向各来回抽拉3次。拔出探针，在颈外动脉近心端用丝线结扎。缓慢松开颈总动脉及颈内动脉显微止血夹。观察有无出血。于伤口涂撒少许青霉素粉末，缝合伤口。放入25 ℃恒温层流室，单笼喂养，每半小时观察小鼠状态，并于3 h后小鼠唇边喂水。所有小鼠术后均存活。各组继续按原来饲料喂养。各组小鼠于颈动脉损伤后第28天清晨麻醉处死。处死前均抽血1 mL。处死后立即分离右侧颈总动脉，并取出颈总动脉放入4%多聚甲醛固定。

1.4检测血糖、血清三酰甘油(TG)及总胆固醇(TC)水平采用生化法检测血糖；采用日本Olympus Type AU2700自动生化分析仪检测血清TG及TC水平。

1.5颈动脉管腔面积、内膜面积、中膜面积、内膜/中膜面积比(I/M)检测右侧颈总动脉4%多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋，制成3 μm厚横断面切片，行HE染色。采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件检测颈动脉管腔面积、内膜面积、中膜面积及I/M。

1.6免疫组织化学染色检测颈动脉内膜p-ERK(ERK的活化表现形式)及MMP-9水平将石蜡切片放入60 ℃烤箱，60 min；脱蜡，水化，抗原修复后滴加一抗，滴加二抗，继而行DAB显色； 复染，脱水，封片：中性树胶；采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对检测颈动脉内膜p-ERK，MMP-9表达进行半定量。棕褐色为阳性表达。以平均光密度乘以阳性面积比即积分光密度值表示每张切片的阳性蛋白表达的相对含量。每张切片随机选取5个高倍镜视野后取平均值。

2结果

2.1各组血糖及血脂(TC、TG)水平与假手术组相比， 糖尿病鼠颈动脉损伤组血糖明显增高(P<0.01)。而与糖尿病鼠颈动脉损伤组相比， PD98059干预组血糖无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1　各组小鼠血糖、TG及TC比较(±s) 　mmol/L

2.2各组小鼠颈动脉组织形态学比较与假手术组相比，糖尿病鼠颈动脉损伤组术后28 d，管腔面积明显缩小，内膜面积、中膜面积及I/M明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2、图1。

PD98059干预组术后28 d，与糖尿病鼠颈动脉损伤组相比，管腔面积明显增加，内膜面积、中膜面积及I/M明显降低(P<0.01)。

表2　各组实验小鼠颈总动脉管腔面积、内膜面积、中膜面积及比较(±s)

注：A为假手术组；B为内膜增生模型组；C为PD98059干预组。

2.3各组小鼠颈动脉内膜MMP-9水平的影响小鼠颈动脉内膜MMP-9水平分别为：假手术组5.21±1.21，糖尿病鼠颈动脉损伤组28.22±6.57， PD98059干预组11.10±2.51。在糖尿病鼠颈动脉损伤组，与假手术组相比，术后28 d颈动脉血管内膜MMP-9表达水平明显增强(P<0.01)。而与糖尿病鼠颈动脉损伤组相比，PD98059干预组颈动脉内膜MMP-9水平明显下降(P<0.05)。详见图2。

图2免疫组化检测各实验组小鼠颈动脉内膜的MMP-9表达(×200)

2.4各组颈动脉内膜ERK比较小鼠颈动脉内膜ERK分别为：假手术组5.28±2.36，糖尿病鼠颈动脉损伤组23.56±3.54，PD98059干预组8.79±3.68。与假手术组相比，糖尿病鼠颈动脉损伤组术后28 d颈动脉血管内膜p-ERK明显增强(P<0.01)，而与糖尿病鼠颈动脉损伤组相比，p-ERK干预组颈动脉内膜p-ERK水平明显下降(P<0.01)。

3讨论

1型糖尿病属于胰岛素依赖型糖尿病，可发生于各年龄段，以儿童和青少年为主。由于胰岛素及降糖药物的普及，1型糖尿病病人生存率及生存质量明显提高，关于1型糖尿病病人动脉硬化及内膜增生的资料尚少，但是随着1型糖尿病病人步入成年或老年化，饮食结构的变化，往往会出现胰岛素抵抗或高脂血症[2]，因此，探讨1型糖尿病病人血管内损伤后内膜是否增生以及增生的机制具有重要的意义。

本研究中INS2AKITA小鼠模型，是一种位于7号染色体的Ins2Akita等位基因突变形成自发性的杂合子1型糖尿病小鼠，与人类1型糖尿病发病机制较类似。本研究显示，将INS2AKITA 给予高胆固醇饮食，再进行颈动脉血管内损伤，较假手术组相比，可见明显的内膜增生，表明实验建立的1型糖尿病颈动脉损伤的内膜增生模型建立成功，为糖尿病颈动脉损伤后内膜增生研究奠定良好的基础。

ERK信号转导通路是MAPK 超家族中重要的传导通路之一，ERK通过磷酸化“瀑布样”级联反应，将细胞外信号跨膜转导至细胞内，导致生物学效应，参与调节细胞的增殖、分化、和组织浸润，与肿瘤、子宫内膜及血管等组织的增殖、增生有有关。研究显示ERK信号参与多种细胞(包括肿瘤细胞及血管平滑肌细胞等)的增生过程[3]。Zhang等[4]研究显示，脂联素通过线粒体融合蛋白-2介导的Ras-Raf-Erk1 / 2的信号级联传导途径的调制影响血管平滑肌细胞增殖和凋亡。本研究显示，抑制血管内膜p-ERK表达可抑制血管内中膜面积及I/M，减轻管腔狭窄，给予ERK抑制剂后，内膜MMP-9表达明显降低。MMP-9由体内多种细胞如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞等产生，是依赖锌离子而降解各种细胞外基质的蛋白酶，MMP-9活化可降解细胞外基质，促进血管内膜组织重构，金属蛋白酶造成内弹力层间隙增宽，血管平滑肌细胞从中膜通过内弹力层迁移到内膜。因此，MMP-9表达上调是内膜增生及细胞增殖过程中的重要炎性介质。在星型胶质瘤细胞，鳞状上皮癌细胞中均发现ERK信号转导途径诱导的MMP-9表达增强[5-6]。另有研究显示，G蛋白偶联受体激酶结合蛋白-1在肝细胞癌中通过激活ERK/MMP-9信号促进肿瘤进展[7]。说明ERK/MMP-9通路在细胞增殖过程中起到重要作用。

虽然实验研究结果表明ERK抑制血管内损伤后内密增生，但是药物在体内的代谢十分复杂，因此需行体外研究进一步证实药物对培养的平滑肌细胞增殖及迁移是否有影响。由于小鼠颈动脉体积很小，损伤的颈动脉提取的蛋白及mRNA有限，不能利用westernblot及RT-PCR检测整个颈动脉的炎症因子基因及蛋白表达，利用免疫组织化学方法，定位内膜，更准确的检测小鼠血管内损伤后颈动脉内膜的MMP-9的表达水平。并且由于INS2AKITA小鼠样本量有限，仅研究颈动脉损伤后28 d该模型小鼠内膜增生的变化情况，对其损伤后1周～2周、3个月及半年后的内膜增生变化尚需进一步研究。

本实验表明， ERK抑制剂可减轻1型糖尿病高胆固醇饮食模型颈动脉血管内损伤后内膜增生；ERK抑制剂可能通过抑制MMP-9等抑制血管平滑肌细胞增生来减轻内膜增生。体内研究和临床试验有待于进一步证实特异性ERK抑制剂对糖尿病病人血管内损伤后内膜增生的医治作用。

参考文献：

[1]Yang D，Wang LL，Dong TT，et al.Progranulin promotes colorectal cancer proliferation and angiogenesis through TNFR2/Akt and ERK signaling pathways[J].Am J Cancer Res，2015，5(10)：3085-3097.

[3]Huang YC，Pan M，Liu N，et al.Effects of nuclear factor-κB and ERK signaling transduction pathway inhibitors on human melanoma cell proliferation in vitro[J].Oncol Lett，2015，10(5)：3233-3237.

[4]Zhang W，Shu C，Li Q，et al.Adiponectin affects vascular smooth muscle cell proliferation and apoptosis through modulation of the mitofusin-2-mediated Ras-Raf-Erk1/2 signaling pathway[J].Mol Med Rep，2015，12(3)：4703-4707.

[5]Kim JH，Choi C，Benveniste EN，et al.TRAIL induces MMP-9 expression via ERK activation in human astrocytoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，377(1)： 195-199.

[6]Kaomongkolgit R，Cheepsunthorn P，Pavasant P，et al.Iron increases MMP-9 expression through activation of AP-1 via ERK/Akt pathway in human head and neck squamous carcinoma cells[J].Oral Oncol，2008，44(6)： 587-594.

[7]Chen J，Yang P，Yang J，et al.GIT1 is a novel prognostic biomarker and facilitates tumor progression via activating ERK/MMP9 signaling in hepatocellular carcinoma[J].Onco Targets Ther，2015，8：3731-3742.

(本文编辑薛妮)

Inhibition Effect of ERK Inhibitor on Intimal Hyperplasia after Carotid Endovascular Injury in Type 1 Diabetes Model

Wang Qizhang， Chen Maogang， Xu Gelin， Liu Xinfeng

Jinling Hospital，Southern Medical University， Nanjing 210002， Jiangsu， China； Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Shenzhen 518104， Guangdong， China

Abstract：Objective To investigate the inhibition effect of extracellular signal-regulated kinase(ERK) inhibitor on intimal hyperplasia after carotid endovascular injury.MethodsThe mice were divided into 3 groups： sham operation group，model group(type 1 diabetes model underwent damage of right common carotid artery)， PD98059 treatment group.HE staining was performed in carotid artery and Image Pro Plus 6.0 image analysis software was used to measure the lumen area， intimal area， medial area and intima/media area ratio (I/M).Immunohistochemical staining was performed to detect the expressions of p-ERK and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in carotid intima.ResultsCompared with sham operation group， the lumen area was decreased， the intimal area， medial area and I/M，the expressions of p-ERK and MMP-9 in carotid intima were significantly increased at 28 days after procedure in model group(P<0.01).Compared with model group，the lumen area was increased， the intimal area， medial area and I/M were decreased at 28 days after procedure in PD98059 treatment group(P<0.05).The expressions of p-ERK and MMP-9 were suppressed， but there was no statistical change for serum glucose， triglyceride (TG)， total cholesterol (TC) in PD98059 treatment group.ConclusionERK specific inhibitor can inhibit MMP-9 expression，and suppress intimal hyperplasia after carotid endovascular injury in type 1 diabetes mice with high cholesterol diet.

Key words：diabetes； extracellular signal-regulated kinase； matrix metalloproteinase-9； endovascular injury； intimal hyperplasia；mice

基金项目：国家自然科学基金(No.81501193)；江苏省自然科学基金(No.BK20141373)

通讯作者：刘新峰， E-mail：wqzflm@163.com

中图分类号：R587R255

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．012

文章编号：1672-1349(2016)08-0837-04

Corresponding Author：Liu xinfeng(Jinling Hospital，Southern Medical University， Nanjing 210002， Jiangsu， China)

(收稿日期：2015-07-01)